最近开始了分子生物学中质粒设计和构建实验，其中设计到无缝连接克隆，正好借着这个机会温故和知新，一只小菜鸟的学习之旅开始了。
一. 最最最基础的PCR反应
聚合酶链式反应(PCR)是基于碱基互补配对原则，通过温度的变化去控制DNA复制的三个主要步骤：变性，退火和复性。下面图1是最基础的PCR扩增循环示意图。
图1. PCR基础扩增过程(三步法) 来自https://www.takarabiomed.com.cn/
Step1 DNA热变性，使得DNA解旋成单链结构；
Step2 退火，使得单链DNA与引物通过碱基配对的原则结合；
Step3 延伸，在DNA聚合酶的作用下，沿着引物3'端合成互补链 (也有将退火和延伸并为一步的去减少反应时间)
Step4 再次进行循环，一般循环25-35次。
而要做好准确并且高效的扩增就需要注意以下两点：
1. 最重要的引物设计
引物设计经常被要求注意的就是GC含量40-60%；长度一般在20bp左右；Tm在60°C左右；3'端不超过2个G/C；避免形成二聚体结构/发夹结构。而5'端要求相对松一些，可以添加酶切位点，重组序列，磷酸化等修饰，最容易忽略的一点就是引物的浓度，但基本上公司合成的primer都会标注稀释最终浓度。关于引物设计的话，现在有很多的工具。比如online的话NCBI，ThermoFisher网站等；线下的话常见Primer Premier，Oligo等，有需要的话可以单独讲一下。
2. DNA聚合酶选择
从最开始的热不稳定DNA聚合酶到热稳定TaqDNA，再到现在Takara，赛默飞，天根等厂家都有的高保真TaqDNA (如图2所示具有外切酶活性的DNA聚合酶) 并结合热启动PCR（如图3所示，在热变性阶段，通过高温将与DNA聚合酶结合的抗体去除，从而在退火阶段进行结合扩增，有效的减少引物的非特异性结合和二聚体的影响)。
图2. 高保真聚合酶 来自赛默飞世尔官网
图3. 热启动PCR 来自Takara官网
二. 传统分子克隆
传统分子克隆是通过限制性内切酶将载体和目的DNA片段产生相配的末端，并通过连接酶将片段连接起来，形成具有目的片段表达的载体。如图4为常规克隆步骤
图4. 传统分子克隆流程 来自赛默飞世尔官网
1.载体的选择与制备
根据实验的目的和条件去选择合适的质粒载体并且选择的质粒要有基本的结构，如用来筛选是否构建成功的蓝白斑lacZα基因；用来检验是否转化成功的AmpR抗性基因；常见的MCS多克隆位点等等。Addgene和Snapgene是非常好用的两个工具。举个简单的例子，可以在addgene上查找pUC19具体的序列或者ID号49793，使用Snapgene打开，基本的features都会被识别，在酶列表中选择合适的酶切位点和酶进行线性化处理。
为了防止剪切后载体的自联，有时候可以将剪切部位暴露出来的5'端进行去磷酸化即用酶去除碱基5'端的磷酸基团，可以有效降低非克隆所需背景。
pUC19质粒图谱
2. 目的片段的制备和插入
目的片段包括Total RNA/mRNA经过反转录合成cDNA；基因组gDNA；cDNA文库；另外质粒的部分等等，目的片段的扩增与第一部分介绍的PCR技术息息相关。
2.1 双酶切插入目的基因
最基础的双酶切法以pUC19质粒为例，使用Snapgene中Enzyme酶功能在多克隆位点MCS处选取合适的酶，酶反应Buffer和incubation条件是克隆成功的关键。同时将具有这两个酶切位点的目的基因片段进行酶切，使用专用试剂盒按照说明书来进行连接，最后要注意载体的自连。
有些情况找不到合适的酶，采用双酶切后将产生的末端平滑化/平端化即将载体和目的片段的的酶切位进行修饰使得粘性末端成为能连接的平末端。
*补充：平端化的酶是大片段的 DNA 聚合酶 I 的大片段(“Klenow 片段”)和 T4 DNA 聚合酶。
2.2 单酶切插入目的基因
某些情况下，可能会选择一种内切酶同时切割插入片段和载体 DNA，以生成连接所需的互补末端。如果出现无法使用单一限制性内切酶的情形，可以考虑换用一对具有不同的识别序列的双酶，产生相匹配的末端进行连接。
所有经过酶切或修饰的片段和载体可以用琼脂糖凝胶电泳进行纯化，去除酶，盐等干扰成分，*注意：切胶过程中减少UV照射，防止DNA损伤。纯净的 DNA 的 A260/A280 比率约为1.8-2，A260/A230 比率约为 2。
3. 连接
将扩增酶切纯化的目的片段和酶切纯化的载体连接，构建完整的载体。Takara，Thermofisher，天根等公司都有相对应的试剂盒和标准化流程的说明书，按照protocol做即可。
4. 转化
转化是细菌细胞吸收外源DNA过程，感受态细胞是常用来做转化的。常见的(1)化学转化感受态细胞是使用氯化钙处理，将处理后的细胞与DNA载体共处理经过42℃热休克1min，后冷却冰浴2-3min，进行后续处理。感受态细胞的选择要根据实际需求来，DH5α，Top10等常用来做质粒的克隆扩增；蛋白表达研究，则菌株应具有 mRNA 稳定性和翻译功能，同时可以较高的重组蛋白表达诱导能力如天根的BL21(DE3)pLysS感受态细胞；还有用来构建DNA库的感受态细胞。(2) 电转化/电穿孔，利用高压脉冲电流击穿细胞，从而使DNA转入到细菌中，Takara，赛默飞都有商用的电转细菌细胞。
5. 单克隆挑取
转化过程中会遇到转化未成功的情况，包括载体未转入到细胞中；转入的载体不含有目的片段；转入了目的片段；转入载体包含了错误的片段等等。所以为了挑选正确的转化单克隆，常常需要多种手段鉴定。
5.1 蓝白斑筛选
所选的感受态细胞中表达突变的lacZ基因 (lacZΔM15)，该基因与质粒上编码的β-半乳糖苷酶 α肽段互补（ α互补）。将经转化的细胞涂布到含有lacZ转录诱导子、IPTG、lacZ显色底物 X-gal （5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷）的生长培养基上。在蓝白斑筛选中，lacZ会水解 X-gal，产生蓝色染料进而形成蓝色菌落。当 DNA 插入片段破坏了载体编码的 lacZα 基因时，无法形成功能性 LacZ，经转化的菌落呈白色，白色单克隆菌落就是转化成功的菌株。
图5 蓝白斑筛选过程 来自赛默飞官网
5.2 抗性基因的筛选
利用质粒载体本身带有的抗性基因进行有效的筛选，既方便又准确。
而后续的目的片段PCR检验或者是质粒载体的测序验证也是必不可少的步骤。
最后将质粒扩增，纯化，完成定量，即完成了一次最最基础的传统分子克隆。
这一部分具体回顾了无缝克隆前期的知识准备包括PCR和传统分子克隆，方便大家对于后面的无缝克隆的理解和接受。后续将持续更新，如有问题，欢迎大家交流讨论。