2021-09-19

Nature | 细胞间CRISPR筛查发现癌细胞吞噬调节因子

原创 huacishu 图灵基因 今天

收录于话题#前沿分子生物学机制

撰文：huacishu

IF=49.962

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亮点：

1、研究表明APMAP的缺失与肿瘤抗原靶向单克隆抗体和阻断CD47的单克隆抗体协同作用相关。

2、本研究利用巨噬细胞中的全基因组反筛选，发现G蛋白偶联受体GPR84介导APMAP缺陷癌细胞的增强的吞噬作用。

3、这项工作揭示了一种对抗体驱动的吞噬作用敏感的癌症内在调节因子，扩展了人们对癌症抵抗巨噬细胞吞噬作用机制的认识。

斯坦福大学医学院Michael C. Bassik教授团队在国际知名期刊Nature在线发表题为“Inter-cellular CRISPR screens reveal regulators of cancer cell phagocytosis”的研究论文。针对肿瘤抗原的单克隆抗体疗法在很大程度上通过触发巨噬细胞吞噬癌细胞来驱动癌细胞的清除。然而，癌细胞逃避吞噬作用的机制尚不完全清楚。本研究中作者开发了一个平台，利用互补的全基因组CRISPR敲除在癌细胞和巨噬细胞中的过表达筛选，对阻碍抗体依赖性细胞吞噬（ADCP）的因素进行无偏差鉴定。在癌细胞中，除了CD47等已知因子外，还发现了许多对ADCP易感性的调节因子，包括脂肪细胞质膜相关蛋白（APMAP）。作者发现，APMAP的缺失与肿瘤抗原靶向单克隆抗体和阻断CD47的单克隆抗体协同作用相关，在广泛的癌症细胞类型中，包括那些对ADCP具有耐药性的细胞，吞噬功能显著增加。此外，APMAP缺失与几种不同的肿瘤靶向单克隆抗体有协同作用，抑制小鼠肿瘤生长。利用巨噬细胞中的全基因组反筛选，发现G蛋白偶联受体GPR84介导APMAP缺陷癌细胞的增强的吞噬作用。这项工作揭示了一种对抗体驱动的吞噬作用敏感的癌症内在调节因子，更广泛地说，扩展了人们对癌症抵抗巨噬细胞吞噬作用机制的认识。

为了确定ADCP的癌症内在调节因子，让携带全基因组CRISPR敲除文库的Ramos淋巴瘤细胞接受巨噬细胞的多轮抗体依赖性杀伤（图1a）。该筛选中最敏感的基因包括编码已知的抗吞噬因子CD47、CD47修饰酶QPCTL和几种参与唾液酸合成的酶，已知这些酶可保护癌细胞免受先天性免疫细胞杀伤（图1b），继而验证该筛选平台识别ADCP调节器的能力。除了这些已知的调节因子外，还发现了许多以前与吞噬功能调节无关的基因，包括基因APMAP（图1b）。接下来，使用CRISPR激活（CRISPRa）筛选来发现在Ramos细胞中未高水平内源性表达的ADCP的其他调节因子（图1c）。该筛选显示了大量的抗吞噬命中和促吞噬命中（图1d）基因。正如预期的那样，CD20为强促吞噬作用因子（图1d）。对CRISPRa筛选的抗吞噬细胞的基因本体富集分析，以及CRISPR敲除和CRISPRa筛选的抗吞噬细胞组合列表（图1e），显示参与唾液酸生物合成和蛋白质唾液酸化的基因高度富集。值得注意的是，一些得分较高的基因是癌基因（GFI1和MUC12）、癌抗原（例如MUC1和LRRC15）、转移驱动因素（例如MUC21、PODXL和SMAGP）或癌症的阴性预后指标（例如C5AR1），但其在肿瘤发生中的作用尚不清楚，以前也未涉及吞噬功能的调节。通过培养弗罗多红标记的Ramos CRISPRa细胞，表达针对每个基因的单导向RNA（SGRNA），并监测靶细胞内化和酸化后红色荧光的时间依赖性增加，验证了其中9个基因作为ADCP易感性的调节因子（图1f）。对于SMAGP，它编码一种特征很差的细胞表面糖蛋白，并且是CRISPRa筛选中最受欢迎的基因之一，在强EF1α启动子下，Flag标记的SMAGP的表达足以保护Ramos细胞免受ADCP的侵袭。接下来，测试了Ramos CRISPRa筛选数据集是否可以用于预测基于其高表达的保护其他癌症细胞系免受ADCP影响的基因。作者注意到SMAGP在结肠癌细胞中高水平表达。用以SMAGP为靶点的Cas9和sgRNAs转导RKO细胞，发现SMAGP的缺失使RKO-Cas9细胞在存在抗CD47抗体的情况下对吞噬作用高度敏感（图1g）。因此，CRISPRa筛选方法能够识别仅在一部分细胞系中高水平表达的抗吞噬因子。为了确定受这些因子过度表达影响的抗体依赖性吞噬的阶段，作者开发了一种基于成像的细胞粘附试验，通过用细胞松弛素D抑制肌动蛋白聚合来评估在没有吞噬的情况下的靶细胞结合（图1h）。作者发现其中一个子集（包括编码粘蛋白MUC1、MUC12和MUC21的基因）的过度表达阻止巨噬细胞在利妥昔单抗存在的情况下与Ramos靶细胞结合，这与报道的粘蛋白过度表达能够封闭癌细胞表面的能力一致（图1h）。大多数基因的过度表达也降低了两种不同抗体—抗CD20和抗CD45与细胞表面的结合，而编码转录阻遏物的GFI1的过度表达则降低了抗CD20结合。相比之下，包括SMAGP和ST6GALNAC1在内的多个基因的过度表达并不影响靶细胞与巨噬细胞的结合或降低抗体结合（图1h）。因此，筛选平台确定了通过多种机制使癌症逃避ADCP的基因。在Ramos CRISPR基因敲除筛查（图1b）和使用抗CD30抗体在Karpas-299 T淋巴瘤细胞中进行的第二次全基因组ADCP筛查（图1i）中，基因APMAP是吞噬敏感性最强的修饰因子之一，提示APMAP在肿瘤逃避吞噬作用中起重要作用。APMAP在人类组织类型和癌症细胞系百科全书的所有细胞系中普遍表达，并在几种恶性肿瘤中过度表达。在个体试验中，在抗CD20和人巨噬细胞存在的情况下，APMAP敲除（APMAPKO）Ramos细胞对ADCP显著致敏，甚至比CD47敲除（CD47KO）细胞更敏感（图1j）。

与CD47KO细胞不同，在没有抗体的情况下，APMAPKO Ramos细胞不比SafeKO对照细胞更容易被吞噬（图2a，b）。进一步测试了APMAP是否会增强CD47阻断的效果。事实上，在两个富含膜蛋白的约3100个基因的子文库的筛选中，APMAP是最受欢迎的，其目的是识别当CD47被删除或阻断时，进一步使细胞对ADCP敏感的基因。此外，在Karpas-299细胞中抗CD47抗体驱动的全基因组吞噬敏感性筛查中，APMAP是最受欢迎的（图2c）。在定量活细胞成像实验中，APMAP缺陷的Ramos细胞在CD47阻断抗体存在时比使用J774巨噬细胞（图2d）或原代人类巨噬细胞的对照细胞对吞噬作用更敏感。APMAP缺失也增强了联合抗CD20和抗CD47治疗诱导的ADCP（图2e）。在一系列实验中，证实了APMAP缺失特异性地使癌细胞对吞噬作用敏感，而不影响已知促吞噬或抗吞噬信号的表达、肿瘤靶向抗体的结合或对一组其他细胞毒性药物的敏感性。APMAP包含一个短胞质结构域、一个跨膜结构域和一个预测的细胞外或内质网内腔结构域（图2f）。为了评估每个结构域对APMAP在保护癌细胞免受吞噬方面的作用的贡献，用编码一系列标记的APMAP等位基因的构建物转导APMAPKO-Ramos细胞。标记为野生型的全长APMAP恢复了APMAPKO Ramos细胞抑制吞噬的能力（图2g）。相比之下，基于PON1的同源性（图2f），预计催化所需的预测钙结合残基的突变消除了ADCP中的APMAP功能（图2g）。尽管如此，该突变体表现出与野生型APMAP相似的表达水平和定位模式。因此，预测的催化活性APMAP包含在其内质网内腔或胞外结构域中，是抑制吞噬作用所必需的。

为了研究APMAP在保护癌细胞免受吞噬作用中的作用是否在其他肿瘤类型中保持不变，检测了来自不同谱系的八种癌细胞系的吞噬敏感性，其中每种细胞系均以中等水平表达APMAP和CD47。对于每一种细胞系，结果发现靶向sgRNAs的APMAP的表达大大增强了细胞对抗CD47驱动的吞噬作用的敏感性（图3a）。在四个小鼠模型中检测了APMAP丢失对肿瘤生长的影响。在前两个模型中，将Ramos淋巴瘤或NCI-H82小细胞肺癌细胞注射到缺乏适应性免疫细胞但含有功能性巨噬细胞的NSG小鼠。用CD47阻断抗体或磷酸盐缓冲盐水（PBS）对照治疗小鼠（图3b）。正如预期的那样，CD47阻断抑制了Ramos和NCI-H82（图3b）肿瘤的发展。值得注意的是，APMAP缺乏增强了CD47阻断剂对两种肿瘤生长的抑制作用，但在没有CD47阻断剂的情况下没有效果（图3b）。在第三个模型中发现APMAP丢失既增加了巨噬细胞浸润，又增强了利妥昔单抗对Ramos肿瘤的作用（图3c）。最后，将小鼠B16-F10黑色素瘤细胞注射到同基因C57BL/6小鼠体内，并用抗TRP1肿瘤靶向抗体治疗。缺乏APMAP的肿瘤对抗TRP1治疗显著敏感。因此，尽管需要进一步的研究来评估靶向APMAP的治疗潜力，但这些实验表明，APMAP缺失增强了多种肿瘤靶向抗体对小鼠肿瘤生长的抑制作用。

假设APMAP缺失通过巨噬细胞受体调节吞噬信号，从而增强癌细胞的摄取。为了确定候选受体，作者进行了基于互补荧光激活细胞分类（FACS）的筛选，这次是利用巨噬细胞中的CRISPR敲除文库，并使用癌细胞作为吞噬靶细胞来确定ADCP的一般调节因子。在将全基因组敲除巨噬细胞与APMAPKO-Ramos细胞孵育后，分离吞噬每种靶细胞类型的巨噬细胞（图4a）。我们对每个分类群体中的sgRNAs进行了深度测序，并进行了两个关键的比较。首先，通过比较双阴性群体，确定了摄取APMAPKO细胞所需的基因，其中包括吞噬所需的关键肌动蛋白调节因子和信号因子（图4b）。其次，我们比较了两个单一阳性群体，以确定摄取APMAPKO细胞所需的选择性基因。该分析揭示了APMAPKO细胞吞噬作用所需的两个特定基因：GPR84和GNB2（图4c）。使用延时成像分析验证了GPR84对于增强APMAPKO细胞的ADCP是必需的；GPR84的缺失消除了人或小鼠巨噬细胞对APMAPKO细胞的增强摄取，但并未减少对SafeKO细胞或CD47KO细胞的摄取（图4d）。在已经缺乏GPR84的细胞中，GNB2或PREX1的缺失仅略微降低了APMAP敲除细胞的ADCP，这与它们在GPR84共同途径中的功能一致。使用中链脂肪酸或两种合成激动剂（ZQ-16和6-OAU）刺激GPR84，刺激SafeKO细胞的抗体依赖性吞噬（图4e），但不刺激APMAPKO细胞。总之，从化学和遗传分析揭示了G蛋白偶联受体信号在APMAP缺陷靶细胞ADCP增强中的作用。

单克隆抗体疗法被描述为癌症治疗中的“魔弹”，因为原则上，它们可以通过巨噬细胞自定义清除癌细胞，而巨噬细胞在大多数肿瘤中都很丰富。然而，肿瘤微环境中巨噬细胞的吞噬活性低下以及癌细胞表达抗吞噬因子仍然是实现单克隆抗体治疗在多种癌症治疗中的应用前景的关键障碍。本研究中作者开发了一种功能基因组学方法，通过在癌细胞和巨噬细胞中进行ADCP调节因子的互补全基因组筛查来研究肿瘤与巨噬细胞的相互作用。研究发现了大量增强或抑制ADCP的基因，这有助于阐明巨噬细胞与肿瘤相互作用的基本生物学，并可能有助于确定新的潜在治疗靶点。

教授介绍

Michael C. Bassik教授来自斯坦福大学医学院，他的实验室利用哺乳动物细胞中高度复杂的shRNA文库和系统遗传相互作用图来了解内吞病原体的生物学以及细胞死亡机制的应激信号。他们还开发了新的工具来进行基因筛选和生成相互作用图，对包括糖尿病在内的健康和疾病状态下的基因组进行功能阐释。创建了全基因组CRISPR/Cas9 sgRNA文库，并将其与shRNA文库并行使用，成功地进行了约150次全基因组筛选。以通讯作者在Nature, Nat Genet, neuron杂志上发表论文多篇。

参考文献

Kamber RA, Nishiga Y, Morton B, et al. Inter-cellular CRISPR screens revealregulators of cancer cell phagocytosis. Nature.2021;10.1038/s41586-021-03879-4. doi:10.1038/s41586-021-03879-4