9：00-9：40
昨天在小郭老师讲述了关于logfc和p值的含义，差不多有点理解的框架。差异倍数(fold change)，fold change翻译过来就是倍数变化。limma接受的输入参数就是一个表达矩阵，而且是log后的表达矩阵（以2为底）。
那么最后计算得到的logFC这一列的值，其实就是输入的表达矩阵中case一组的平均表达量减去control一组的平均表达量的值，那么就会有正负之分，代表了case相当于control组来说，该基因是上调还是下调。
假设A基因表达值为1，B表达值为3，那么B的表达就是A的3倍。一般我们都用count、TPM或FPKM来衡量基因表达水平，所以基因表达值肯定是非负数，那么fold change的取值就是(0, +∞)。为什么我们经常看到差异基因里负数代表下调、正数代表上调？因为我们用了log2 fold change。当expr(A) < expr(B)时，B对A的fold change就大于1，log2 fold change就大于0（见下图），B相对A就是上调；当expr(A) > expr(B)时，B对A的fold change就小于1，log2 fold change就小于0。通常为了防止取log2时产生NA，我们会给表达值加1（或者一个极小的数），也就是log2(B+1) - log2(A+1)。
为什么不直接用表达之差，差直接有正负啊？假设A表达为1，B表达为8，C表达为64；直接用差B相对A就上调了7，C就相对B上调了56；用log2 fold change，B相对A就上调了3，C相对B也只上调了3. 通过测序观察我们发现，不同基因在细胞里的表达差异非常巨大，所以直接用差显然不合适，用log2 fold change更能表示相对的变化趋势。
p值是在统计学的范畴假设检验首先必须要有假设，我们假设A和B的表达没有差异（H0，零假设），然后基于此假设，通过t test（以RT-PCR为例）算出我们观测到的A和B出现的概率，就得到了P-value，如果P-value<0.05，那么说明小概率事件出现了，我们应该拒绝零假设，即A和B的表达不一样，即有显著差异。
显著性只能说明我们的数据之间具有统计学上的显著性，要看上调下调必须回去看差异倍数。
10：00-11：50
回过头解决了一些关于火山图出现的问题，这是因为我没有之前基因表达量没有取log，导致坐标太大。[图片上传失败...(image-74d97e-1575537977972)]
13：00-17：00
下午还是对代码块进行注释，然后比较观察之前做的图有什么不对劲的 。
options(stringsAsFactors = F)
load(file = 'step1-output.Rdata')
# 每次都要检测数据
exp[1:4,1:4]
table(group_list) #table函数，查看group_list中的分组个数
#通过为每个数据集绘制箱形图，比较数据集中的数据分布
boxplot(exp[1,]~group_list) #按照group_list分组画箱线图
bp=function(g){ #定义一个函数g，函数为{}里的内容
library(ggpubr)
df=data.frame(gene=g,stage=group_list)
p <- ggboxplot(df, x = "stage", y = "gene",
color = "stage", palette = "jco",
add = "jitter")
# Add p-value
p + stat_compare_means()
}
bp(exp[1,]) ## 调用上面定义好的函数，避免同样的绘图代码重复多次敲。
bp(exp[2,])
bp(exp[3,])
bp(exp[4,])
dim(exp)
library(limma)
design=model.matrix(~factor( group_list ))
fit=lmFit(exp,design)
fit=eBayes(fit)
## 上面是limma包用法的一种方式
options(digits = 4) #设置全局的数字有效位数为4
#topTable(fit,coef=2,adjust='BH')
topTable(fit,coef=2,adjust='BH')
## 但是上面的用法做不到随心所欲的指定任意两组进行比较
design <- model.matrix(~0+factor(group_list))
colnames(design)=levels(factor(group_list))
head(design)
exprSet=exp
rownames(design)=colnames(exprSet)
design
contrast.matrix<-makeContrasts("Normal-ACC",
levels = design)
contrast.matrix ##这个矩阵声明，我们要把 Tumor 组跟 Normal 进行差异分析比较
colnames(design)
deg = function(exprSet,design,contrast.matrix){
##step1
fit <- lmFit(exprSet,design)
##step2
fit2 <- contrasts.fit(fit, contrast.matrix)
##这一步很重要，大家可以自行看看效果
fit2 <- eBayes(fit2) ## default no trend !!!
##eBayes() with trend=TRUE
##step3
tempOutput = topTable(fit2, coef=1, n=Inf)
nrDEG = na.omit(tempOutput)
#write.csv(nrDEG2,"limma_notrend.results.csv",quote = F)
head(nrDEG)
return(nrDEG)
}
deg = deg(exprSet,design,contrast.matrix)
head(deg)
save(deg,file = 'deg.Rdata')
load(file = 'deg.Rdata')
head(deg)
bp(exp[rownames(deg)[1],])
## for volcano
if(T){
nrDEG=deg
head(nrDEG)
attach(nrDEG)
plot(logFC,-log10(P.Value))
library(ggpubr)
df=nrDEG
df$v= -log10(P.Value) #df新增加一列'v',值为-log10(P.Value)
ggscatter(df, x = "logFC", y = "v",size=0.5)
df$g=ifelse(df$P.Value>0.01,'stable', #if 判断：如果这一基因的P.Value>0.01，则为stable基因
ifelse( df$logFC >1,'up', #接上句else 否则：接下来开始判断那些P.Value<0.01的基因，再if 判断：如果logFC >1.5,则为up（上调）基因
ifelse( df$logFC < -1,'down','stable') )#接上句else 否则：接下来开始判断那些logFC <1.5 的基因，再if 判断：如果logFC <1.5，则为down（下调）基因，否则为stable基因
)
table(df$g)
df$name=rownames(df)
head(df)
ggscatter(df, x = "logFC", y = "v",size=0.5,color = 'g')
ggscatter(df, x = "logFC", y = "v", color = "g",size = 0.5,
label = "name", repel = T,
#label.select = rownames(df)[df$g != 'stable'] ,
label.select =head(rownames(deg)), #挑选一些基因在图中显示出来
palette = c("#00AFBB", "#E7B800", "#FC4E07") )
ggsave('volcano2.png')
ggscatter(df, x = "AveExpr", y = "logFC",size = 0.2)
df$p_c = ifelse(df$P.Value<0.001,'p<0.001',
ifelse(df$P.Value<0.01,'0.0010.01'))
table(df$p_c )
ggscatter(df,x = "AveExpr", y = "logFC", color = "p_c",size=0.2,
palette = c("green", "red", "black") )
ggsave('MA.png')
}
## for heatmap
if(T){
load(file = 'step1-output.Rdata')
# 每次都要检测数据
dat[1:4,1:4]
table(group_list)
x=deg$logFC #deg取logFC这列并将其重新赋值给x
names(x)=rownames(deg) #deg取probe_id这列，并将其作为名字给x
cg=c(names(head(sort(x),100)),#对x进行从小到大排列，取前100及后100，并取其对应的探针名，作为向量赋值给cg
names(tail(sort(x),100)))
library(pheatmap)
pheatmap(dat[cg,],show_colnames =F,show_rownames = F) #对dat按照cg取行，所得到的矩阵来画热图
n=t(scale(t(dat[cg,])))#通过“scale”对log-ratio数值进行归一化，现在的dat是行名为探针，列名为样本名，由于scale这个函数应用在不同组数据间存在差异时，需要行名为样本，因此需要用t(dat[cg,])来转换，最后再转换回来
n[n>2]=2
n[n< -2]= -2
n[1:4,1:4]
pheatmap(n,show_colnames =F,show_rownames = F)
ac=data.frame(g=group_list)
rownames(ac)=colnames(n) #将ac的行名也就分组信息（是‘no TNBC’还是‘TNBC’）给到n的列名，即热图中位于上方的分组信息
pheatmap(n,show_colnames =F,
show_rownames = F,
cluster_cols = T,
annotation_col=ac,filename = 'heatmap_top200_DEG.png') #列名注释信息为ac即分组信息
}
write.csv(deg,file = 'deg.csv')