由iPSC领域开创者Yamanaka等人在2017年发表在Nature Reviews Drug Discovery上的综述，总结了诱导多能干细胞技术十年以来的进展
Induced pluripotent stem cell technology: a decade of progress | Nature Reviews Drug Discovery
以下为上半部分翻译：
要点
- 自2007年问世以来，人类诱导多能干细胞（iPSC）技术发展迅速。
- 人类iPSC技术已广泛用于疾病建模；例如，用于神经退行性疾病和精神疾病。
- 人类iPSC技术已经产生了几种候选药物，目前正在进行临床试验。
- 首次使用人类iPSC衍生产品治疗年龄相关性黄斑变性的临床试验已经启动。
- 与基因编辑和3D 类器官技术的结合使iPSC平台更加强大。
- iPSC技术的持续发展及其与其他技术的集成有可能对疾病建模、药物发现和再生医学做出重大贡献。
摘要
自十年前诱导多能干细胞（iPSC）技术问世以来，干细胞生物学和再生医学取得了巨大进展。人类iPSCs已广泛用于疾病建模、药物发现和细胞治疗开发。新的病理机制已经阐明，来自iPSC筛选的新药正在研发中，并且首次使用人类iPSC衍生产品的临床试验已经启动。特别是，人类iPSC技术与基因编辑和3D类器官的最新发展相结合，使得基于iPSC的平台在其应用的各个领域（包括精密医学）都更加强大。在这篇综述中，我们讨论了与药物发现和再生医学特别相关的iPSC技术的应用进展，并考虑了该领域其他的挑战和新出现的机遇。
背景
2006 年，科学和医学领域取得重大技术突破，有报告称通过使用四种转录因子的混合物，可以从小鼠体细胞（如成纤维细胞）中生成具有类似于胚胎干细胞（ESCs）的基因表达谱和发育潜力的细胞1。这些细胞被称为诱导多能干细胞（iPSCs），四种因子——OCT4、SOX2、KLF4和MYC——被命名为“Yamanaka 因子”。仅仅 1 年后，两个研究小组独立报道了从人类成纤维细胞中生成 iPSCs2,3。
自 2007 年以来迅速发展的人类 iPSC 技术（BOX 1）为干细胞生物学和再生医学领域以及疾病建模和药物发现领域开创了一个激动人心的新时代。该技术开发后不久，人类 iPSC 被迅速应用于生成人类“培养皿中的疾病”模型，并用于药物筛选的功效和潜在毒性。鉴于对表型筛选的兴趣激增以及人类 iPSC 在疾病建模中与传统细胞筛选相比的优势，这种方法现在变得越来越流行。这些优势包括它们源自人类、易于获取、可扩展、能够产生几乎任何所需的细胞类型、避免与人类 ESC 相关的伦理问题，以及使用患者特异性 iPSC 开发个性化药物的潜力。此外，基因编辑技术的最新进展——特别是 CRISPR–Cas9 技术——正在快速生成基于基因修饰的人类 iPSC 疾病模型。 iPSC 也是新一代更具生理代表性的细胞平台的关键组成部分，该平台包含 3D 架构和多种细胞类型。
BOX 1 |人类 iPSC 技术的演进
自 2006 年开始，诱导多能干细胞 (iPSC) 技术发展迅速。由于 iPSCs 最初是通过整合病毒载体（例如逆转录病毒或慢病毒载体）引入重编程因子而产生的，因此由于转基因整合到宿主基因组中引起的插入诱变的可能性，这些 iPSCs 的临床应用受到关注细胞 204.
为了使 iPSC 在临床上更适用，已经开发了各种非整合方法来规避与逆转录病毒和慢病毒转导介导的重编程因子引入相关的插入诱变和遗传改变的风险 205。这些非整合方法包括使用游离 DNA 206,207、腺病毒208、仙台病毒209、PiggyBac 转座子210、小环211、重组蛋白212、合成修饰的mRNA213、微小RNA214,215 和小分子216进行重编程，尽管小分子方法尚不适用于诱导生成人类iPSC。
在这些方法中，游离型 DNA、合成 mRNA 和仙台病毒通常用于衍生无整合的 iPSC，因为它们相对简单和高效185。使用非病毒方法或非整合病毒可以避免基因组插入，从而降低人类 iPSC 用于临床应用时的相关风险。
iPSC 技术也因其在再生医学中的潜在应用而引起了相当大的兴趣。第一项评估人类 iPSC 衍生细胞的临床研究于 2014 年启动。该研究使用人类 iPSC 衍生的视网膜色素上皮 (RPE) 细胞治疗黄斑变性4，据报道该治疗可改善患者的视力5。尽管由于在第二名患者的 iPSC 中发现了两个基因变异，该试验随后被搁置，但预计将继续进行 6。
显然，人类 iPSC 技术对人类疾病建模、药物发现和基于干细胞的治疗具有很大的前景，而这种潜力才刚刚开始被实现。在本文中，我们概述了自该技术发现以来的十年中 iPSC 在每个主要应用中的进展。我们提供了关键的说明性示例，讨论了其限制和解决方法，并强调了出现的新机遇。
基于 iPSC 的疾病建模
识别人类疾病的病理机制对于发现新的治疗策略具有关键作用。动物模型为人类疾病建模提供了宝贵的工具，能够识别不同发育阶段和体内环境中特定细胞类型的病理机制。此外，在小鼠中，有可能开发基于 iPSC 的体外疾病模型和对应的体内模型。将观察到的表型与相应的体外和体内小鼠模型进行比较，可以更好地了解基于体外人类 iPSC 模型的强度和局限性。
然而，实质性的物种差异可能会阻止在最常用的动物模型（例如小鼠）中重现完整的人类疾病表型。例如，尽管已经为阿尔茨海默病创建了许多转基因小鼠模型，但没有一个模型能够捕捉到人类疾病病理学的整个谱系，包括大量的神经元损失 7、8。这种疾病重演的缺乏可能是由于小鼠和人类神经细胞之间的基本物种差异。因此，迫切需要建立人类疾病建模平台来补充使用动物模型进行生物医学研究的研究。
使用原代患者来源的细胞建立疾病模型有助于研究人类疾病的病因学，并为这些疾病制定治疗策略。然而，缺乏来自患者的可扩展的原代细胞来源是一个关键的限制，特别是一些难以获得的细胞，如脑细胞和心脏细胞。因此，人类iPSCs是一个有吸引力的选择，因为原则上人类疾病(特别是那些有明确遗传原因的疾病)可以很容易地使用来自不同患者的容易获得的细胞类型(如皮肤成纤维细胞和血细胞)来建立iPSCs模型。由于其固有的自我更新特性和分化为体内几乎任何细胞类型的潜力，患者特有的iPSCs可以提供大量与疾病相关的细胞和以前无法获得的各种不同类型的细胞，如神经元和心肌细胞。此外，由于 iPSC 可以来自相关患者本身，它们可以实现个性化的疾病建模，这将成为精准医学的核心部分。
人类 ESC 和 iPSC 都已用于模拟人类遗传疾病。早期的模型是使用 ESC 开发的，但随着人类 iPSC 技术的出现，因为它们的可用性和没有使用人类 ESC 相关的潜在伦理问题，人类 iPSC 已成为首选。人类 iPSC 与人类 ESC 高度相似。这两种类型的细胞都表达人类多能因子和 ESC 表面标志物，并表现出分化成三个胚层的发育潜力2,3。体细胞的残余表观遗传记忆可能发生在 iPSCs10-12 中，这可能会影响这些细胞的分化潜能。尽管在 iPSCs10-12 中已经报道了亲代细胞的表观遗传记忆的持久性，但在大多数情况下，在使用人类 ESCs 和 iPSCs 的疾病建模中已经报道了类似的表型，这支持了使用源自患者的 iPSCs 进行疾病建模的有效性。
使用人类 iPSC 进行疾病建模的过程始于获得含有致病突变（或多个突变）的 iPSC（图 1）。然后这些细胞分化成与疾病相关的细胞类型。所得细胞用于揭示疾病病因和鉴定病理机制。在基于 iPSC 的疾病建模的早期研究中，来自未受疾病影响的个体的 iPSC 被用作患者来源的 iPSC 的对照。然而，与其他细胞类似，iPSC 表现出谱系间变异，这使数据解释变得复杂，因为必须将谱系变异与真正的疾病相关表型区分开来。
图1|基于人类IPSC的疾病建模示意图。建立和使用基于人类诱导多能干细胞(IPSC)的疾病模型通常包括以下步骤。首先，iPSCs来自患者个体，并使用CRIPSR-Cas9等基因编辑技术创建同基因型对照。然后，将iPSCs分化为特定的细胞类型，如神经细胞，并对生成的细胞进行研究，以确定疾病的特定表型。在分子水平上研究这些表型可以识别新的病理机制，为药物发现和个性化药物提供机会。
快速发展的基因组编辑技术现在能够以特定位点的方式将基因改变引入 iPSC，包括纠正患者来源 iPSC 中引起疾病的基因突变，以及将特定突变引入非疾病影响的野生型 iPSC。这些方法能够生成以引入突变为唯一变量的基因匹配的同基因型iPSC 系，确保能可靠地识别真正的病理学原因，同时避免与可能的谱系间变异导致的遗传背景或附带现象的任何差异混淆。在对散发性或多基因疾病进行建模时，同基因型 iPSC 的控制将特别重要，因为其表型差异很小14。
可编程位点特异性核酸酶的开发，包括锌指核酸酶 (ZFN)15,16、转录激活因子样效应核酸酶 (TALEN)17-19 和 CRISPR-Cas9 系统20-23（表 1），显著改善了基因通过在基因修饰位点诱导 DNA 双链断裂来提高人类 ESC 和 iPSC 的编辑效率。尤其是 CRISPR-Cas9 技术因其设计简单且易于使用而备受关注，并在人类 ESC 和 iPSC 的基因编辑中得到广泛应用。这种基因编辑技术使研究人员能够将致病突变引入野生型 iPSC，并消除患者 iPSC 中的此类突变，从而为基于 iPSC 的疾病建模创建同基因型对照（图 1）。
然而，在使用CRISPR-CAS9技术的应用中，一个主要的挑战是可能产生偏离目标的效果。然而，尽管CRISPR-Cas9在癌细胞系24中描述了相对较高水平的非靶标基因修改，但最近来自多个实验室使用全基因组测序(WGS)的报告表明，在正常人类细胞中，包括人的iPSCs和ESCs25-29，非靶标基因修改是罕见的。使用从原始iPSCs和相应的基因编辑iPSCs中分离的基因组DNA的WGS，结合全面的生物信息学分析25，27-29，对于检测脱靶效应(如单核苷酸变体(SNV)和插入或缺失(INDELs))是有用的，特别是对于将用于临床应用的细胞。目前，WGS价格昂贵，但预计随着技术的发展，成本将会下降。检测脱靶效应的替代方法包括外显子组测序30和靶向深度测序29。对于靶向深度测序，人们可以使用Cas-OFFinder31来搜索与人类基因组中的靶外位点不同的潜在的靶外位点，Cas-OFFinder31是一种用于识别非靶标位点的算法，包括非靶标SNV或INDELs。
基因编辑工具也在不断改进和完善，这可能有助于解决脱靶效应问题。最初的CRISPR-Cas9技术通过使用单个引导RNA指导的野生型Cas9核酸酶诱导DNA双链断裂来编辑基因组位点。由成对的引导RNA指导的Cas9的尼克酶(nickase)版本(D10A突变体)和具有增强特异性的工程Cas9核酸酶变体(ESpCas9)现在越来越多地被用于基因组编辑32-34，因为两者都显示出大大减少了脱靶效应，同时保持了严格的靶标切割34，35。此外，催化死亡的Cas9(dCas9)与转录激活因子或抑制因子融合可用于调节内源基因(所谓的CRISPRi或CRISPRa)的转录，或通过与荧光蛋白32-34、36融合来调节基因组位点的转录。对CRISPR-CAS9系统的修改还能够以精确的单等位基因或双等位基因的方式高效地显式引入DNA序列变化37。碱基编辑方面的一项最新进展利用了CRISPR-Cas9和胞苷脱氨酶的融合，使胞苷能够直接转化为尿苷，而不需要DNA双链断裂38。这一新方法提高了基因编辑效率，并将进一步促进人类ESCs和iPSCs的基因编辑。
基于iPSC的疾病模型被广泛用于研究由单基因突变引起的具有早期发病的特征的疾病(单基因疾病)39，40。这种方法非常适合于此类疾病，因为iPSCs可以很容易地从患者身上分离出来，并分化为与疾病相关的细胞，如神经元。此外，鉴于iPSCs41分化的细胞相对不成熟，更有信心的是，iPSCs分化的细胞表型为早发与晚发的疾病提供了一个很好的模型，对于这些疾病，细胞老化可能在疾病病理学中很重要。例如，从患者来源的iPSCs分化出的神经元被用来模拟脊髓性肌萎缩症(SMA)，这是一种由存活运动神经元1(SMN1)39突变引起的早发性疾病。SMN1基因的突变会导致运动神经元的退化和随后的肌肉萎缩。1型SMA患者通常在出生后6个月出现症状，病情进展迅速，到2岁时会致命42。在最初的基于IPSC的疾病模型研究39中，从1型SMA患者的成纤维细胞中获得的IPSC被分化为一种与疾病相关的细胞类型，运动神经元。从患者来源的iPSCs分化出的运动神经元与来自未受影响的对照组的运动神经元相比，存活率降低。此外，用丙戊酸和妥布霉素(两种已知可诱导SMN1表达的化合物)处理患者来源的iPSCs后，SMN1蛋白和含有SMN1蛋白的“GEM”水平增加(参考文献。39)。这项研究提供了患者来源的iPSCs可以用来模拟早发性遗传性疾病并作为潜在的药物筛选平台的原则证据。
对发病较晚的疾病进行建模更具挑战性，因为从人类iPSCs分化而来的细胞通常表现出类似胎儿的特性。然而，诱导细胞老化已被用来帮助成功地模拟迟发性疾病43-46。诱导从人iPSCs分化而来的细胞衰老的一种方法是用细胞应激源处理这些细胞：例如，使用以线粒体功能或蛋白质降解通路为靶点的MG-132和吡咯菌酯等化合物。另一种诱导细胞衰老的方法是异位表达导致过早衰老的基因产物，如progerin。然而，细胞应激源或progerin的表达是否能通过与正常衰老相似的机制诱导细胞衰老仍有待确定。此外，最近的研究表明，细胞成熟和老化可能是不同的事件41，48。目前尚不清楚细胞老化诱导剂是否可以促进细胞成熟和衰老，而不是在未成熟细胞中引发细胞衰老48。或者，直接重编程方法，包括将人成纤维细胞直接转化为其他特定血统的细胞，如神经元，不会消除细胞老化标记49。事实上，来自老化成纤维细胞的神经元通过直接重新编程维持细胞年龄50岁，因此为研究与年龄相关的疾病提供了一种替代的细胞模型。值得注意的是，在促进细胞成熟方面也取得了成功，例如通过使用改进的培养液配方51或使用神经元-星形胶质细胞共培养系统52、53。
iPSCs还提供了一种研究散发性（sporadic ）疾病(其原因尚未在患者的家族病史或基因突变中确定)的新方法，这一点很重要，因为许多疾病的大多数患者都有散发性疾病。例如，在阿尔茨海默病中，95%的患者属于散发性类别。有趣的是，对来自散发性阿尔茨海默病患者的IPSC来源的神经细胞的分析发现，几个零星病例表现出与由特定基因突变引起的家族性阿尔茨海默病相同的表型54。这一发现表明，使用ipscs对散发性疾病进行重新分类的可能性。然而，使用iPSCs模拟散发性疾病通常比模拟单基因疾病更困难，因为这类疾病的表型变化通常被认为是由多个小遗传风险变异结合环境因素引起的。尽管来自散发性疾病患者的iPSCs可能包含与疾病相关的风险变量，但因为遗传和表观遗传背景的谱系差异，使用iPSCs来模拟此类疾病是复杂的。这种变异对于模拟散发性疾病更有问题，因为散发性疾病iPSC来源的细胞的表型预计比那些来自单基因疾病的iPSC来源的表型更细微。
因此，基于人类iPSC的散发性疾病模型的一个关键问题是如何产生仅在相关风险变量14上不同的成对同基因型细胞系。使用CRISPR-Cas9技术，产生以特定疾病相关遗传风险变异为唯一变量的受基因控制的同基因型iPSC系的能力可以创建一个受控良好的系统。 最近，这种方法被用来产生不同于帕金森病相关风险变量的同基因型iPSC系，与等位基因特异性分析相结合，能够有力地剖析这种遗传风险变量55。这一实验策略可用于研究与其他疾病相关的遗传风险因素。
到目前为止，已经使用源自 iPSC 的单一疾病相关细胞类型研究了许多疾病。例如，iPSC 衍生的神经元已被用于模拟阿尔茨海默病 54、56-68（表 2）和帕金森病 43-45、55、69-84（表 3）。然而，可能需要不止一种细胞类型来有效地模拟某些疾病。事实上，类似的努力已经致力于使用患者 iPSC 衍生的神经元 85-87 和神经祖细胞 88-92 来模拟精神分裂症。为了更好地概括疾病表型，可能还需要一种以上细胞类型的共培养来研究不同细胞类型的相互作用。例如，星形胶质细胞-神经元共培养物已被用于模拟肌萎缩侧索硬化( ALS )93–96。这种共培养系统使研究疾病病理学的非细胞自主方面成为可能，否则，单细胞类型（如神经元）就不可能做到这一点。此外，这些研究有助于确定星形胶质细胞是导致肌萎缩侧索硬化症运动神经元变性的关键细胞成分，并为使用患者iPSC衍生星形胶质细胞93-96进行肌萎缩侧索硬化症的药物筛选提供了平台。
使用3D类器官可以更好地模拟不同细胞类型之间的相互作用。使用小鼠和人类的组织干细胞和多能干细胞97，已经为包括大脑、视网膜、肠道、肾脏、肝脏、肺和胃在内的多个器官生成了类器官。由于与内源性细胞组织和器官结构相似，人类iPSC衍生的类器官已被开发用于各种应用，并且特别有用，因为它们能够在模拟人类生理和发育的细胞环境中研究细胞-细胞相互作用。事实上，3D类器官已被用于模拟人体器官发育和疾病，测试治疗性化合物和细胞移植98-114（表4）。在类器官中可以按照时空顺序生成多种生理相关的细胞类型。此外，由于三维结构中不同细胞类型（如神经元和星形胶质细胞）的相互作用，在类器官中生成的细胞在功能上可能比使用定向分化培养衍生的细胞更成熟。因此，3D类器官有助于在发育相关的时空背景下解剖疾病病理学，并有可能在器官水平而不是单个细胞水平上模拟药物反应。
虽然3D类器官为基于iPSC的疾病建模提供了非常有前景的工具，但类器官技术存在局限性。一个挑战是创建一个与传统2D培养相比效率和可复现性更高的类器官平台115。最近，具有3D设计的小型旋转生物反应器的应用使前脑类器官的生成具有高重复性110。开发更标准化的类器官培养基，以及更明确的细胞外基质，将进一步促进生成高度可重复的类器官系统，该系统更适用于准确的疾病建模、药物发现和治疗开发116。另一个挑战是当前类器官系统缺乏血管97。因此，由于缺乏持续的营养供应，类器官的生长和成熟受到限制。旋转生物反应器和振荡培养平台能够提供更好的营养供应，并促进类器官的生长110，117。此外，与内皮细胞共培养能够在类器官99中生成血管样网络。此外，将体外生成的人类类器官移植到动物宿主的相关部位有助于类器官的血管化和成熟。当研究需要增大尺寸和改善成熟度的类器官时，可以应用这种移植方法。