【分享篇】癌症蛋白相互作用与AP-MS

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大多数的细胞信号和监控回路是通过密集的蛋白质-蛋白质相互作用网络(PPIs)维持的。基因突变，表观遗传学的改变，以及细胞微环境的改变干扰PPIs的模式，从而导致癌细胞肿瘤生长。越来越多的证据表明，靶向特异性PPI的药物可能比抑制原癌基因蛋白活性的药物具有更高的特异性和疗效。因此，在一个特定的癌症中识别PPIs不仅提高了我们对个别癌症的认识，而且为治愈特定的癌症提供了治疗机会。

图1

非小细胞肺癌中异常互作蛋白的形成

最新研究表明，表皮生长因子受体(EGFRs)显著改变了肺癌患者的PPI模式(图1b)。大约20%的肺腺癌在EGFR基因的第19外显子(从746到750个氨基酸缺失)或第21外显子(L858R)发生基因突变，导致相应的癌组织对EGFR信号通路产生强烈的致癌依赖。

图2

分析临床样本互作蛋白的新方法

越来越清楚的是, 在肿瘤细胞营养和新陈代谢竞争环境下PPI模式可以明显异常,分析个体癌症中PPI模式将展示其最新的重组细胞信号调节通路的状态,进而提供至关重要的信息如何解决给定的特定的癌症。

亲和纯化质谱(AP-MS)是发现新型PPIs的独特平台，可扩展到大规模分析(图2a)。利用亲和标记，AP-MS分离与靶蛋白物理结合的相互作用蛋白，并通过蛋白酶处理诱导这些蛋白裂解为多肽。产生的肽被电离，然后根据它们的质量电荷比(m/z)进行分离。

图3

整个液相色谱和串联质谱分析进一步增强了基于质谱的蛋白质组学的敏感性，这使得即使在单残基也可以检测翻译后修饰。AP-MS是一种与数据库依赖的分析，为在单个样本中识别PPIs提供了较好的数据量。然而，质谱数据的解释是基于获得的m/z值以一对一的方式分配给特定的肽段，这使得质谱分析在很大程度上依赖于现有的数据库，因此研究人员进行分析。基于质谱的方法也容易受到污染，会以相同的比率产生假阳性结果。

因此，当质谱方法用于比较多个临床样本时，其通量将受到限制，这些临床样本通常携带异质性遗传和表观遗传变化。近距离连接法(Proximity ligation assay, PLA)是一种很有前途的临床标本中PPIs检测方法。通常将样品加入两种类型的抗体，每一种抗体分别针对PPI对中的两种蛋白质中的一种。这些抗体要么直接用寡核苷酸标记(称为聚乳酸探针)，要么用带有寡核苷酸标记的二抗检测。目标PPIs的存在使两个PLA探针接近(通常小于40 nm)。两种聚乳酸探针杂交形成环状DNA模板，通过滚转环状扩增和扩增得到环状DNA模板然后用荧光标记的互补核苷酸检测。

图4

PLA法最近被用于观察检测EGFR在非小细胞肺癌患者标本中的PPIs。PLA的一个突出方面是在细胞环境中PPI复合物组装的亚细胞位置检测PPIs。此外，该方法还可直接应用于脱蜡的甲醛固定石蜡包埋样品。相反，由于PLA本质上是基于细胞蛋白在稠密的细胞质中的免疫标记，因此抗体与目标蛋白结合的效率很大程度上取决于具体的样本条件。用于滚动扩增、反应时间、背景荧光和聚乳酸斑点密度的聚合酶和连接酶可进一步增加PLA信号的波动。

图5

利用小型反应室和自动成像系统，可以在1小时内评估100种不同的PPI。由于单分子co-IP需要裂解步骤，它失去了PPI络合物原来的空间分布。因此，不适合分析单个肿瘤块的细胞间异质性。相反，单分子co-IP中的PPIs发生在细胞或组织裂解液中，比原始的细胞细胞质稀释得多。因此，PPI反应在单分子中，co-IP主要受简单的质量作用规律支配，由此产生的PPI计数与依赖于在稠密细胞质中进行免疫标记的免疫组织化学和PLA相比，其波动大大减小。然而，单分子co-IP分析的一个主要缺点是它需要新鲜的速冻样品，通常是那些保存在液氮中的样品。

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AP-MS蛋白互作质谱分析