用科学思维迎接挑战——参加生物联赛体会

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1实验时间：2017.7.26-2017.7.31

2实验名称：龟类体表分泌物中抗菌肽的分离纯化

3实验材料和试剂：养殖场龟池水、纱布、型号为001×7的即用氢型强酸阳离子交换树脂、Nacl、乙醇、碳酸氢钠、EDTA、。

4实验器材/设备：低速离心机、铁架台、层析柱、恒流泵、透析袋。

5实验方法:

2017.7.26

将养殖场龟池水经过多重纱布过滤，去除可见性杂质。然后低速离心机离心，取上清液，进一步去除杂质，获得500ml粗分离龟池水。离心机转速设为3000g，时间设定为15min。

2017.7.27

对强酸阳离子交换树脂进行预处理，取一定量的树脂用去离子水进行漂洗，每隔15min换水一次，浸洗时不时搅动，浸洗5次后，浸洗水不带褐色，泡沫很少。将树脂装柱，将经过粗分离的龟池水直接连续不断的过柱，以便使其充分吸附。抗菌肽所带的是正电荷，被树脂中的负电荷所吸附，因此龟池水中的抗菌肽就可以被吸附到阳离子树脂中。利用恒流泵控制速度为0.2ml/min。

2017.7.29

选用3mol/L的NaCl为洗脱液，洗脱吸附过抗菌肽的柱子，洗脱液为配制的500ml的3mol/L Nacl，利用恒流泵控制速度为0.2ml/min。

2017.7.31

透析袋进行预处理，把透析袋剪成20cm的小段，用400ml 50%乙醇煮沸1h，依次用 200ml 50%乙醇、1L 0.01mol/L碳酸氢钠、40ml0.5mol/LEDTA溶液洗涤，最后用蒸馏水反复冲洗，最后4℃保存于蒸馏水中。用透析袋透析，在透析袋内放置20ml洗脱液，用透析夹子夹住透析袋放置于盛有500ml去离子水的烧杯内。第一次透析时间为3h,第二次换水过夜透析。

1实验时间：2017.8.1

2实验名称：抗菌肽粗提液的抑菌实验

3实验材料和试剂：牛皮纸。

4实验器材/设备：烘箱、高压蒸汽灭菌锅、涂布器、接种环。

5实验方法:抑菌实验中将透析液和未透析液分为原液组、稀释一倍液组、稀释两倍液组以及一个空白对照组，抑菌实验选择大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草杆菌，即共需21个培养皿。首先，将洗得干净透明的培养皿晾干，用牛皮纸包好之后再用高压蒸汽灭菌锅将培养皿灭菌，即在103.4KPa、121.3℃的灭菌条件下灭菌20分钟至30分钟。再将灭菌后的培养皿取出放在38℃的烘箱里将其中的水珠烘干以供倒平板使用。一般过夜烘干即可。实验中所需要的涂布器和接种环也要在此次过程中灭菌以供使用。

1实验时间：2017.8.2

2实验名称：抗菌肽粗提液的抑菌实验

3实验材料和试剂：大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、胰蛋白胨、NaCl、NaOH、琼脂。

4实验器材/设备：锥形瓶、电子天平、摇床、高压蒸汽灭菌锅、无菌操作台、接种环。

5实验方法:培养皿烘干后，进行LB固体、LB液体培养基的配制。100mLLB液体培养基配方：100mL水+1g胰蛋白胨+0.5g酵母的提取液+1gNaCl+200μLNaOH。液体培养基配置三份，每份100ml分装在三个锥形瓶内。100mL固体培养基的配方：100mL水+1g胰蛋白胨+0.5g酵母的提取液+1gNaCl+200μLNaOH+1.5g琼脂。固体培养基配置1L。培养基配制好之后在103.4KPa、121.3℃的灭菌条件下灭菌30分钟。液体培养基完全冷却以供接下来的实验使用。抑菌实验选择大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草杆菌，需要先在已经冷却好的液体培养基中摇菌培养一段时间，因为防止有些细菌处于休眠或者无生命活性阶段。即在无菌操作台上在酒精灯旁用接种环将细菌接种至LB液体培养基锥形瓶内，然后在摇床上37℃恒温，转速为200培养12h。

1实验时间：2017.8.3

2实验名称：龟类体表分泌物中抗菌肽的抑菌实验

3实验材料和试剂：大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草杆菌。

4实验器材/设备：恒温水浴锅、牛津小杯、无菌操作台、移液枪、恒温箱。

5实验方法:将恒温水浴锅温度设置为99℃，然后将固体培养基融化，冷却后在酒精灯旁边以及在无菌操作台上倒平板。依次将不同的细菌涂到平板上，各个培养皿上需要贴上相应细菌名称的标签以区分开来。每个平板中统一用移液枪加入200μL的已经摇好的菌液，然后在酒精灯旁边、超净工作台上将不同的细菌用涂布器涂布到培养基上。接种的全程都需要在无菌的环境下进行。在已经接种好细菌的每个培养基上均匀的放置3个牛津小杯，每杯滴加20μL的抗菌物质，再贴好标签以便接下来区分。抑菌实验中抗菌物质分为：透析液原液组、透析液稀释一倍液组、透析液稀释两倍液组、未透析液原液组、未透析液稀释一倍液组、未透析液稀释两倍液组以及一个空白对照组，然后37℃恒温箱培养。实验涂好菌、加好抗菌物质后就进行分组培养。放在37℃的恒温箱里培养8至12个小时，取出观察抑菌圈的大小。

第一次实验结果不理想，继续第二次实验。

团队指导老师所在的实验室长期从事龟鳖类动物饲养和龟鳖动物系统进化研究，同时也开展生物化感作用的分子机制等研究。我目前为大二学生，正在学习细胞生物学、微生物学理论课以及实验课。而且通过以前对动物学、生物化学、生态学等学科的学习，现已基本掌握相关学科的实验技能，如蛋白质的定性定量分析；也基本了解分子生物学等学科实验方法，如生物大分子的分离纯化技术等。除了对相关学科知识和实验技能的积累掌握，我还通过选修课基本了解论文的写作要求和格式规范等知识。在平时日常生活中，我培养了自己对自然科学的喜爱，养成了勤思考多动手的良好习惯。通过指导老师的教导，我了解到了关于抗菌肽的一些知识。抗菌肽一般是指相对分子质量在10000以下,具有某种抗菌活性的多肽类物质。它们具有水溶性好、热稳定性强、免疫原性低、抗菌谱广的特点。抗菌肽不仅具有抑菌作用而且还具有抗病毒和抑制肿瘤细胞的作用，由于其对正常细胞无破坏作用和无耐药性 ,有望成为新一代的抗肿瘤、抗菌候选药物.因此，从来源丰富的天然材料中提取抗菌肽，开发抗菌肽药用资源有一定的应用前景。本研究拟采用离子交换层析、透析袋浓缩、抗菌鉴定等方法，将溶解在池水中的低浓度龟类体表分泌物——抗菌肽进行分离纯化，并进行活性分析。在过去的学习中，虽没有什么科研方面取得的好成绩，但我会把握机会，认真上好每一次实验课和一些理论课，积极与团队成员和老师进行交流，向老师学习一些课外知识，这样的经历让我渐渐地喜欢上了这种学术氛围并立志于在自然科学道路上的深造。我也希望在指导老师的指导下，学到更多的科学知识、掌握更多的实验技能、了解一些前沿知识、体会科学的真谛！通过此次实验，我和队友遇到了很多挫折，想了很多应对的办法。尽管作为一名本科生，知识和能力都有限，却也学会了很多。感谢学校给我这次锻炼的机会，感谢老师给我的耐心指导，感谢师兄师姐的热心回答，感谢队友时时刻刻的帮助！

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