我的第二次RNAseq分析
数据还是上次那些，因为我没法解决.count文件里面的数字全是0的情况。所以打算从头开始做。
这次我对流程更加熟练了，另外又看了不少攻略，理解也更深了一些
##########################
1 基因组索引的建立
##########################
需要从ensemble的FTP下载一个.fa文件和一个.gtf文件（或者.gff3）
genomeFastaFiles 这个参数可以使用 .fna .fa这两种文件格式--sjdbGTFfile这个选项可以使用.gff3 .gtf这两种格式可以用。
这次我用的是Danio_rerio.GRCz10.dna.toplevel.fa 和Danio_rerio.GRCz10.87.gtf 这两个文件。
不要用GCF_000002035.5_GRCz10_genomic.fna 和Danio_rerio.GRCz10.87.gtf的组合！
不要用Danio_rerio.GRCz10.dna.toplevel.sm.fa和Danio_rerio.GRCz10.87.gtf的组合！
一定要用这个文件啊 Danio_rerio.GRCz10.dna.toplevel.fa
命令如下：
/public/opt/sc/program/STAR-STAR_2.4.1c/source/STAR \
--runThreadN 20 \
--runMode genomeGenerate \
--genomeDir /public/home/iemb315/genome \
--genomeFastaFiles /public/home/iemb315/Danio_genome/Danio_rerio.GRCz10.dna.toplevel.fa \
--sjdbGTFfile /public/home/iemb315/Danio_genome/Danio_rerio.GRCz10.87.gtf \
--sjdbOverhang 149 得到如下：
Mar 13 11:28:11 ..... Started STAR run
Mar 13 11:28:11 ... Starting to generate Genome files
Mar 13 11:29:02 ... starting to sort Suffix Array. This may take a long time...
Mar 13 11:29:20 ... sorting Suffix Array chunks and saving them to disk...
Mar 13 11:39:33 ... loading chunks from disk, packing SA...
Mar 13 11:40:41 ... Finished generating suffix array
Mar 13 11:40:41 ... starting to generate Suffix Array index...
Mar 13 11:52:15 ..... Processing annotations GTF
Mar 13 11:52:30 ..... Inserting junctions into the genome indices
Mar 13 11:58:43 ... writing Genome to disk ...
Mar 13 11:58:45 ... writing Suffix Array to disk ...
Mar 13 11:58:59 ... writing SAindex to disk
Mar 13 11:59:01 ..... Finished successfully
如果需要根据不同基因组调整参数需要自己阅读STAR的manual
或许会总是报错 Segmentation fault (core dumped) 。管理员说是段错误。多试几次可能就好了。
##########################
2 mapping reads
##########################
把公司给的文件用filezillar 上传然后解压
gunzip /public/home/iemb315/xhb/W1_H7NNKALXX_L2_1.clean.fq.gz
gunzip /public/home/iemb315/xhb/W1_H7NNKALXX_L2_2.clean.fq.gz
gunzip /public/home/iemb315/xhb/M1_H7NNKALXX_L2_1.clean.fq.gz
gunzip /public/home/iemb315/xhb/W1_H7NNKALXX_L2_2.clean.fq.gz
解压后会覆盖掉原有的压缩文件，运行head W1_H7NNKALXX_L2_2.clean.fq 查看一条read多长
比对WT
cd /public/home/iemb315/xhb/wt
/public/opt/sc/program/STAR-STAR_2.4.1c/source/STAR \
--runThreadN 20 --genomeDir ~/genome \
--readFilesIn ~/xhb/W1_H7NNKALXX_L2_1.clean.fq ~/xhb/W1_H7NNKALXX_L2_2.clean.fq \
--sjdbGTFfile /public/home/iemb315/Danio_genome/Danio_rerio.GRCz10.87.gtf \
--sjdbOverhang 149 cd /public/home/iemb315/xhb/mt
/public/opt/sc/program/STAR-STAR_2.4.1c/source/STAR \
--runThreadN 12 --genomeDir ~/genome \
--readFilesIn ~/xhb/M1_H7NNKALXX_L2_1.clean.fq ~/xhb/M1_H7NNKALXX_L2_2.clean.fq \
--sjdbGTFfile /public/home/iemb315/Danio_genome/Danio_rerio.GRCz10.87.gtf \
--sjdbOverhang 149在各自的目录下得到两个很大的.sam文件，以及一些运行日志。
/public/home/iemb315/xhb/wt/public/home/iemb315/xhb/mt###################################################
3 使用samtools预处理sam文件，这个工具不用安装，服务器本身就有。###################################################
进入wt mt的目录
使用view
samtools view -bS Aligned.out.sam > MT_march.bam
samtools view -bS Aligned.out.sam > WT_march.bam
使用sort
samtools sort -m 10G -@ 2 WT_march.bam WT_march.sorted
samtools sort -m 10G -@ 2 MT_march.bam MT_march.sorted
一定要查看一下生成的bam文件
samtools view -H WT_march.sorted.bam > header
samtools view -H MT_march.sorted.bam > header
#############################
4 使用htseq-count给reads计数
#############################
~/python27/Python-2.7.10/bin/htseq-count -f bam -r pos -s no --mode=intersection-nonempty ./WT_march.sorted.bam ~/Danio_genome/Danio_rerio.GRCz10.87.gtf >WT.count
~/python27/Python-2.7.10/bin/htseq-count -f bam -r pos -s no --mode=intersection-nonempty ./MT_march.sorted.bam ~/Danio_genome/Danio_rerio.GRCz10.87.gtf >MT.count
如果所计算出的count全部为0,有可能是因为比对用的gff文件和htseq-count用的gff文件不一致造成的 现在来看是.fa文件版本不对
5 使用DESeq2处理.count文件
######################################################
把两个.count文件下载到自己windows的环境变量目录下。
安装anaconda 安装Rstudio
DESeq2的安装
source('http://bioconductor.org/biocLite.R')biocLite('DESeq2')
library('DESeq2')
directory<-'~/test'
sampleFiles<-grep('t',list.files(directory),value=TRUE)
# sampleFiles
sampleCondition<-c('mt','wt')
sampleTable<-data.frame(sampleName=sampleFiles, fileName=sampleFiles, condition=sampleCondition)
ddsHTSeq<-DESeqDataSetFromHTSeqCount(sampleTable=sampleTable, directory=directory, design=~condition)
ddsHTSeq
#######确定顺序
colData(ddsHTSeq)$condition<-factor(colData(ddsHTSeq)$condition, levels=c('mt','wt'))
dds<-DESeq(ddsHTSeq)
res<-results(dds)
res<-res[order(res$padj),]
head(res)
write.table(res, file="ddseq2.xls", sep="\t",quote=F)