RNA-seq 中生物重复与测序深度的权衡

  RNA-seq可以从核酸层面为各种生物研究提供支持，最常见的就是实验处理下差异表达基因的筛选；并且随着测序成本减少，RNA-seq已经是大多数实验的标配。
  有时候，项目经费有限的情况下，我们应该怎么设计实验，尽可能地达到实验目的，需要考虑到实验重复和测序深度的选择。
  这儿有篇文章详细讨论了RNA-seq 中生物重复与测序深度的选择：
Efficient experimental design and analysis strategies for the detection of differential expression using RNA-Sequencing. BMC Genomics.2012 Sep 17;13:484. doi: 10.1186/1471-2164-13-484.

实验重复

在生物学实验中，实验重复分为生物重复和技术重复：

• 生物重复:对不同样本进行同样的实验操作，然后纳入一起进行分析。
• 技术重复：实验重复之间只有操作时间的差异，对同一样本进行一致的处理。

通常情况下，技术重复上的误差我们可以通过实验设计和操作的改进得以减小；然而，生物样本间的差异是难以控制的。

RNA-seq中， 重复的设计是实验设计不可缺少的一部分：

• 实验中的不稳定性和样本之间差异引起的误差。
• 能不能达到我们所期望的统计功效。在分析基因差异表达时，也就是最终得到多少差异显著的基因。
• 有助于FDR的改善

TPR与FPR

文章对TPR与FPR的估计：

文章作者将剪切体（ isoforms）分为非调节子集（non-regulated subset）, 上调子集（an up-regulated subset ）和 下调子集 （a down-regulated subset）；进而估算显著水平α下的TPR与FPR。
解释一下TPR与FPR，
TPR（True positive rate, sensitivity, power of test）: 对应的名字就是有这么多，真阳性，敏感度，检验功效；具体来说就是，样本处理后差异表达的基因经过RNA-seq分析被发现的数量占总的差异表达基因数的比例；一组小鼠喂食某种药物相对于正常喂食的对照组有800个差异表达基因；RNA-seq分析找到400个差异表达基因，其中有300个基因也存在于前面800个差异表达基因中，所以TPR=300/800
FPR（False positive rate ):本来就不差异表达的基因，RNA-seq分析却错误的认为是差异表达基因数占总的非差异表达的基因数的比例；一组小鼠喂食某种药物与正常喂食的对照组相比，有19200个非差异表达基因；RNA-seq分析找到400个差异表达基因，其中有300个基因也存在于前面800个差异表达基因中，剩下的100原本就应该不是差异表达基因，所以FPR=100/19200

第一类错误和第二类错误：

1-β (power of the test，检验功效): 当Ha正确时，拒绝Ho。

生物学重复对筛选差异表达基因的影响：

测序深度不变，随着生物重复增加（n=2 -> n=12），差异表达基因检出率从0.44%提升到5.12%；FPR从0.04%上升到0.06%，最终再回到0.04%；TPR从3.26%提升到41.57%。总的来说，差异表达基因检出率和TPR有了明显上升，FPR保持不变。
  在RNA-seq实验设计中，更多的生物重复不仅可以提高差异表达基因检出率，还可以提高差异表达基因检出质量和可靠性。

测序深度对筛选差异表达基因的影响：

  对于不同生物重复实验情况下，随着测序深度的减少，FPR有着缓慢降低的趋势，但始终低于0.1%；而TPR降低的趋势明显一些，尤其是在15%以下迅速降低。灰色实线是n个生物重复在 1/n的测序深度下TPR值的变化，TPR随着n增加改善，这种趋势一直持续到n=32与n=96；但从n=32增加到n=96，TPR改善的效果并不大。

  不同生物重复和测序深度实验条件下FPR与TPR值。
  表2中，所有组合条件下，FPR始终低于0.1%，并且随着生物重复增加和测序深度增加，FPR只从0.02%（n=2, depths = 25%）增加至0.04%（n=12, depths =100%）；
  表3中，随着生物重复增加和测序深度增加，TPR不断改善， TPR从1.57%（n=2, depths = 25%）增加至41.57%（n=12, depths =100%）；

总结

RNA-seq实验设计中，生物重复对TPR有明显的影响，提高差异表达基因检出的质量和可靠性；
  在RNA-seq实验设计中，测序深度在从100%降到15%，对TPR和FPR产生的影响可以忽略；
  测序技术已经得到了很好地发展，测序深度一般可以满足，因此实验设计中可以考虑适当增加生物重复数；现在，一般最少做三个样本重复，但是三个有时候并不一定足够。