【转录组-1】RNAseq基本知识

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概念

广义：转录组（transcriptome）是特定细胞在某一功能状态下转录本的总和。同一细胞在不同的生长时期及生长环境下，其基因表达情况是不完全相同的，具有特定的空间性和时间性。

狭义：转录组是指直接参与蛋白质的mRNA的总和

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各种RNA的功能

mRNA：编码基因
tRNA:携带氨基酸到核糖体上进行蛋白质的合成
rRNA:与多种蛋白质结合成核糖体，作为蛋白质生物“合成”的装配机

micro RNA/mi RNA :调控基因表达
snoRNA(核仁小RNA)：参与rRNA成熟加工
snRNA(核内小分子RNA)：参与mRNA的剪接
gRNA(引导RNA)：参与RNA编辑
SRP-RNA（信号识别颗粒）参与蛋白质分泌
dsRNA(双链RNA)：基因沉默
IncRNA长链非编码RNA：表达调控
······

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RNA-seq分类

• 1.测序物种：原核转录组和真核转录组 还有宏转录组

• 2.建库测序类型：常规转录组和 链特异性转录组（可以识别来自那一条链）

• 3.有无参考序列： 有参考序列的RNAseq和无参考序列的denovo RNA-seq

• 4测序目标：IncRNA、sRNA等

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RNA与DNA测序之间的差异

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转录组测序技术的发展

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分子杂交：RT-PCR（Real Timeq PCR）通过对经典PCR扩增反应中的每个循环产物荧光信号的实时检测，我们可以实现对模板的定量分析，通过正确设定引物（primer）和探针（probe）,qRT-PCR技术可以很大范围内定量检测目标转录本的拷贝数，即表达水平。

EST（Expressed sequence tags）：表达序列标签。是指从不同组织来源的cDNA序列，通过对一个随机选择的cDNA克隆进行单次测序来获得cDNA的部分序列，只要测序到一个基因的EST片段，就能证明这个基因是有表达的。EST是基于测序的，并不需要事先知道待检测转录本的序列。

基因表达的连续分析技术（Serial Analysis of Gene Expression,SAGE）能同时对上千个转录本进行研究。
SAGE技术的主要依据有两个：
（1）一个9~10碱基的短核苷酸序列标签包含足够的信息，足以特异性的确定某一种转录本。
（2）如果将短片段标签相互连接，集中形成长的DNA分子，则对该克隆进行测序将得到大量连续的单个标签，并能以连续的数据形式输入计算机中进行处理，这样就可以对数以千计的mRNA转录本进行分析，这个和DGE技术有些类似。

基因芯片（genechip）也叫微阵列（ microarray）通过将几十万个不等的探针（probe）分子固定在约1厘米见方的固体片基上制成。利用核苷酸分子在形成双链时碱基互补配对的原理，微阵列可以一次性检测出样本中所有与探针互补的核苷酸片段，从而快速得到样本中基因的表达谱（expression profile）
缺陷：只能检测已知物种的转录表达情况，无法检测芯片中不包含的序列，并且不容易定量。

数字基因表达谱DGE（Digital Gene Expression Profiling）DGE利用新一代高通量测序技术和高性能计算分析技术，能够全面、经济、快速的检测到某一物种特定组织在特定状态下的基因表达情况。
缺陷： 基于序列标签进行测序，只能适用于真核生物，不适合原核生物。

以上技术缺陷：
第一： 需要依赖已知参考序列，如果没有一直序列，就无法捕获。
第二：通量低，一次不能捕获全部的转录情况
第三：只能定性，不能定量，只能确定有无，不能确定多少。只能确定一个基因是否表达，不能确定表达量的多少。
第四： 不适合所有物种

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RNA-seq与基因芯片的比较

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RNA-seq技术优势

• 1RNAseq直接得到核酸序列信息，除了可以得到基因表达量的差异，更可以检测RNA结构和结构变异。

• 2 开放性的转录组分析：无需参考基因组信息，无需设计探针，不但能检测已知基因还能发现新的转录本。

• 3 在测序覆盖度足够大时能够检测细胞中的低丰度转录本。

• 4 随着测序深度的增加，可以获得更广的动态检测范围，能够同时鉴定和定量高丰度和低丰度转录本，定性和定量都更加准确。

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