title: 文献笔记-Where, When, and How Context-Dependent Functions of RNA Methylation Writers, Readers, and Erasersinfection
date: 2019-11-22 12:00:00
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- 天然免疫
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注：以前看综述的时候，我喜欢把原文逐字翻译为汉语，效率比较低，现在我就采用笔记的形式的来看综述，按照原文的结构，把关键点记录下来，再加上自己的理解即可。
文献信息
Hailing Shi, Jiangbo Wei, Chuan He,Where, When, and How: Context-Dependent Functions of RNA Methylation Writers, Readers, and Erasers,Molecular Cell,Volume 74, Issue 4,2019,Pages 640-650,
ISSN 1097-2765,https://doi.org/10.1016/j.molcel.2019.04.025.
摘要
细胞RNA会天然地经历各种化学修饰。这些经化学修饰的核苷酸又赋予了其自身结构的多样性，从而在各种有序的代谢与机体的功能方面发挥着各种调控功能，进而影响了基因的表达。随着对回贴(mapping)位点修饰的全转录组测序方法的发展，对精确修饰进行检测和定量的高灵敏质谱方法的进步，以及参与修饰的“效应器”(effectors，包括各种能改变各种修饰位点的酶，例如写入器(writers)和擦除器(erasers)和能识别化学修饰位点的读取器(readers)）理解的加深，最近几年有关RNA修饰的研究呈现暴发式地增长。然而由于RNA种类庞杂，表达水平有差异，因此这给RNA修饰的研究带来了很大的挑战，另外，RNA的修饰还与细胞类型，组织特异性，以及修饰效应器的定位有关，这又增加了研究难度。我们在这篇综述里，重点阐述了最近几年关于-甲基化转换酶(m6A, )功能的研究进展，强调了环境(context)对RNA修饰调控和功能的重要性。
前言
早期研究发现，m6A主要发生在(G/A)(m6A)C序列上。最近的研究发现，m6A主偏向于出现在终止密码子和3'UTR上，因此我们可以推断，m6A可以影响基因的表达。
m6A途径的效应器(effectors)包括写入器(writers)，擦除器(erasers)和读取器(readers)，其中写入器往核苷酸上添加上甲基，擦除器反之，即去掉核苷酸上的甲基，读取器则是能够识别那些核苷酸上含有甲基的序列，它们的成员如下图的Figure 1所示：
机体的整个生物学环境会影响m6A通路，并且决定了m6A的功能。
一方面，不同的细胞，以及环境刺激能影响m6A这些
效应器自身的表达水平，PTM以及细胞定位。例如，在多数细胞系中，m6A的去甲基化酶(demethylase)FTO主要位于细胞核，并且参与5%-10%的的mRNA的m6A去甲基化，但是在某些淋巴瘤细胞系中，这个比例达到40%。
另一方面，RNA分子自身的异质性又增加了m6A的研究难度，这是因为：
①RNA种类繁多，包括mRNA，tRNA，rRNA，以及其它大量的非编码RNA；
②不同类型的细胞中的RNA丰度不同；
③RNA存在着复杂的二级结构；
④RNA存在着不同的转录状态（例如非活跃时，RNA与组蛋白紧密结合，转录活跃时，则与组蛋白松开）；
⑤RNA中的顺式/反式作用元件（例如一些RNA结合蛋白，RBP, RNA binding proteins）会调控m6A效应子与RNA底物。因此说，m6A的活动与环境紧密相关。
m6A甲基化的写入器
m6A是通过一个复合物加到mRNA上的（Figure1），这个复合物有多个亚基，包括METTL3，METTL14，WTAP，VIRMA，ZC3H13，HAKAI，RBM15/15B。其中包括以下成员：
- METTL3/14，全称是methyltransferase-like 3/14，即甲基转移酶3/14， 这两个甲基转移酶是这个复合物的核心成员，其中MELLT3起催化作用，MELLT14促进复合物与RNA结合。
- WTAP，全称是Wilms tumor 1-associating protein，其功能是结合METTL3/14，诱导它们向底物招募以及定位。
- VIRMA，全称是Vir like m6A methyltransferase associated，功能是将m6A与3'UTR结合。
- ZC3H13，全称是zinc finger CCCH-type containing 13，功能是诱导写入器复合物向核内转移。
- RBM15/15B全称是RNA binding motif protein 15/15B，功能是与尿嘧啶富集区域结合，促进某些RNAs的甲基化。
METTL3的功能
METTL3在各类细胞中的分布不同，例如在HeLa细胞中，METTL3/METTL14会形成二聚体结构与WTAP产生相互作用，然后进入细胞核形成斑点(speckle)。METTL3和WTAP中含有NLS(nuclear localization signals)，NLS的突变会导致复合物无法入核。METTL3还存在于一些细胞质中，例如在一些癌细胞系，包括HeLa，MDA-MB-231，MOLM13细胞系等。还有一些情况，例如在小鼠皮质神经元中，METTL14位于细胞质和细胞核。现在还不清楚为什么METTL3的定位为什么会出现如此差异。METTL3/METTL14的比例在不同的细胞系中也有差异，这可能会影响METTL3的定位。
写入器的招募导致了转录本上的m6A的特异性，这一招募过程可能是由TF或表观遗传标记介导的，如下下图的Figure 2所示：
METTL3在细胞核中的作用
当出现热休克时，METTL3就会定位到染色质的热休克相关的基因上，m6A就会被添加到热休克转录本上，从而诱导这些转录本在应激压力下被清除。UV诱导DNA破坏时，METTL3/14就会在2分钟内定位到UV诱导的损伤位点，同时伴随着m6A活动的增强。在人类多能干细胞的TGF-信号转录通路转导方面，活化的SMAD2/3会与METTL3/14-WTAP相互作用，诱导m6A添加到特定的转录本上。在AML细胞中，一部分METTL3会通过METTL14非依赖方式与CCAAT增强子结合蛋白zeta(CEBPZ)的启动子区域结合。在HepG2细胞中，H3K36me3能通过与METTL14相互作用招募写入器，诱导mRNA的CDS和3'UTR上添加m6A。
METTL3在细胞质中的促进翻译作用
METTL3还能作为一个潜在的m6A读取器，在Figure 2B中，我们可以看到，在肺癌细胞中，METTL3此时并没有发挥催化作用，而是在细胞质中锚定到了3'UTR上，促进了一个报告mRNA的翻译。进一步的研究表明，METTL3是通过eIF3h相互作用来促进翻译的。
METTL3蛋白自身会通过PTM或与其它蛋白质相互作用来发挥调控功能，例如人类的METTL14能够诱导METTL3的丝氨酸399磷酸化。人类的METTL3会出现SUMOylation修饰，导致METTL3/14的活性降低。但这些现象的机制还不清楚。
序列和结构特异性诱导的甲基化
METTL3/14复合物偏爱RRACH模序(R=A或G；H=A，C或U)，METTL16则偏爱另外的序列与结构。METTL16被验证的两个特异性序列是U6(U6 small nuclear RNA, snRNA)和人类MAT2A(methionine adeno-syltransferase 2A)上的一个发夹结构(hp1)，MAT2A编码S-腺苷甲硫氨酸合成酶(S-adeno-sylmethionine synthetase, SAM synthetase)。有实验分析发现，METTL16偏爱一个形成茎环结构膨大处的UAC(m6A)GAGAA序列。EMTTL16介导的MAT2A甲基化是SAM稳态的负反馈信号。最近发现了ZCCH4是一个新的m6A读取器。
m6A读取器
m6A读取器通过作用于含有m6A的mRNA来发挥作用，Figure 1中可以把读取器分为三类。
第一类读取器含有YTH结构域（YTH的全是YT521-B homology），这些成员包括YTHDF1-3(YTH domain family 1-3)，YTHDC1-2(YTH domain containing 1-2)（参考Figure 1）。细胞质中的YTHDF2会通过招募CCR4-NOT腺嘌呤酶复合物来诱导靶转录本的部分降解。细胞质中的YTHDF1和YTHDF3能促进HeLa细胞中靶转录本的翻译。细胞核中的YTHDC1有多个作用，包括招募某些剪接因子调控mRNA的剪接，促进mRNA的输出，加速某些转录本的降解。YTHDC2调控mRNA的稳定，翻译以及精子形成。
第二类读取器是HNRNPs，全称是heterogeneous nuclear ribonucleoproteins，成员包括HNRNPC，HNRNPG与HNRNPA2B1，它们能调控靶转录本的剪接，加工，它们能与RNA的某些结构结合，这些结构是由m6A介导形成的，因为m6A会重构局部的RNA结构，调控RNA-蛋白质之间的相互作用，这一现象称为m6A开关(m6A-switch)。
第三类读取器含有相同的RNA结合结构域(RBD, RNA binding domains)，例如KH结构域(K homology)，RNA识别模序(RNA recognition motif)，以及RGG( arginine/glycine-rich)结构域，它们都能与含有m6A的mRNA结合，包括FMR1和IGF2BP1-3。FMR1(Fragile X mental retardation 1)含有3个KH结构域，1个RGG结构域，它有可能通过与YTHDF1和YTHDF2相互作用来影响RNA的转移，RNA的稳定。IGF2BP1-3(insulin-like growth factor 2 mRNA-binding proteins 1–3)能通过m6A的方式稳定靶转录本（YTHDF2与之相反，它是降解靶转录本）。IGF2BP蛋白功能的核心是KH3-4结构域，这是与m6A结合的关键区域。
Prrc2a是最近发现的一个读取器，它与髓鞘形成有关，具体机制不明。
为什么读取器会结合一些m6A位点
以下为作者的几个猜测。
第一，读取器有可能与其它的RBP相互作用，从而被招募到mRNA的不同区域。IGF2BP1-3和YTHDF2通过在不同位点来调控mRNA的稳定性，例如IGF2BP1-3结合到3'UTR，而YTHDF2结合到CDS区。而RBP对RNA的识别取决于多个因素，例如结合位点的序列，序列的侧翼以及RNA的二级结构。因此RBP与读取器蛋白质的相互作用有可能涉及了m6A位点的特异性。
第二，m6A位点的密度和序列也可能与之有关。
第三，读取器蛋白会在细胞区室的特定位点富集，因此会偏向与局部一些RNA类型结合。例如，YTHDF1-3，FMR1和HNRNPA2B1位于细胞的应激颗粒核心地区。在乳腺癌细胞中，YTHDF1-3，HNRNPK和IGF2BP2-3位于细胞的突起(protrusion)。
甲基化可以促进翻译或影响某一转录本的稳定性，这取决于揎细胞环境下哪个读取器占据主导地位，如Figure 3所示：
读取器对外界刺激的应答
在某些刺激下，例如热休克应激或病毒感染会诱导细胞质中的YTHDF进入细胞核。在热休克出现的几小时内，YTHDF2的转录本与蛋白水平都上升，并且多数YTHDF2转移到细胞核内。有人认为，YTHDF2核心的YTHDF2会与去甲基化酶FTO竞争，阻止那些热休克应答基因5‘UTR的去甲基化，从而增强这些基因在细胞质中非加帽方式的翻译(cap-independent translation)。体外实验发现，YTHDF2能抑制FTO的去甲基化活性。在Vero细胞感染实验中，细胞感染了enterovirus type 71后，YTHDF1和YTHDF2会上调，并且在感染12小时后分布在细胞质，感染24小时后分布在细胞核，这一现象机制不明。
在有丝分裂后期的细胞中，当需要功能蛋白时，YTHDF1的翻译促进作用就变得特别明显(Figure 3)。在损伤诱导的轴突再生的背根节(DRG)模型中，再生相关基因大量地被甲基化，在这个恢复过程中，YTHDF1是蛋白质强烈合成所必需的条件；相比之下，YTHDF1在损伤前的基础翻译增强方面，作用很小。这一现象与最初在HeLa细胞中研究YTHDF1时类似，YTHDF1会促进一些转录本的翻译。在关于记忆研究方面，有研究发现，YTHDF1的缺陷会导致海马依赖性神经元功能出现障碍，恢复YTHDF1的蛋白水平，则能修复这种问题。YTHDF1依赖的翻译增强会在一些癌细胞中持续出现，而在其它一些细胞中则是由刺激诱导的，这一过程是如何触发的，还不清楚。
读取器的不同功能
YTHDF1-3的结构类似，它们都含有N末端低复杂序列，和C末端的保守YTH结构域。但是它们的功能并不相同，在不同的细胞中，它们有的能促进蛋白翻译，有的能抑制蛋白翻译，具体的案例可以参考原文。并且在不同的m6A阅读器蛋白之间还存在着交叉作用或竞争作用，即使在FTO和阅读器之间，也有着类似的作用。因为这些蛋白本身就构成了一个有相互作用的网络结构，因此要理解它们的环境调控作用对于相关的研究有着重要意义。
m6A擦除器
m6A甲基化可以被FTO或ALKBH5逆转，这两个蛋白也就是m6A擦除器。FTO是第一个被发现的m6A擦除器。FTO能够去甲基化m6Am，以及部分mRNA上的cap-m6Am，如Figure 4所示：
CLIP-seq验证了很多FTO的结合位点，这些结合位点包括tRNAs，snRNA等。FTO的空间分布也能发挥调控作用，FTO的N末端有一个NLS，它能部分地分布在细胞核中，也能分布在细胞质中，FTO的分布在不同的细胞系中有所不同，例如在AML细胞中的分布和HEK，HeLa细胞中的分布就不同，这可能与肿瘤的发生有关，FTO在AML细胞中的这种分布也有可能是环境依赖的，因为2HG(2-hydroxy-glutarate)能抑制FTO。
CLIP-seq的测序数据分析表明，在某些细胞系中，FTO偏爱结合GAC-和/或GGAC模序。有研究发现，FTO的表达和定位可能被PTM调控（例如Lys-216）。
位于mRNA的5'cap中的+1核糖上，它几乎是与内部m6A(internal m6A，这个内部指的是mRNA中间的部分)同时发现的。m6A可能占据了整个腺苷酸的0.1%-0.4%，它主要发生在第二个核苷酸2’-O-methylated()的帽子结构附近。只有不到30%的含有m6Am。m6Am的比例占到整个mRNA的m6A十分之一或更低（在一些细胞系中还要低）。m6A丰度要远高于，因此，虽然FTO更偏爱结合，但是FTO的主要靶点还是m6A。由于几乎所有的mRNA帽子结构都在胃镜核中被加帽蛋白结合，因此在细胞核中，cap-不太可能被去甲基化，这也反映了FTO对的局限，如Figure 4所示。现在研究发现的FTO还功能涉及：热休克应答，UV损伤应答，HCV感染等方面。
mRNA的甲基化不影响转录本的稳定
最初研究认为FTO介导的的去甲基化在功能上类似于DCP-2介导的去帽(decapping)化诱导mRNA的降解以及miRNA介导的mRNA降解。当敲低FTO后，FTO的靶mRNA出现了很多变化，这些效应被认为是由于的去甲基化导致的，但是FTO敲低与那些只含有m6A或转录本水平之间的相关却不支持这个结论，并且发现只有内部m6A修饰的转录本的变化与FTO的敲低相关。
后来发现了PCIF1是mRNA的甲基转移酶，它只加工，却不加工内部的m6A(internal m6A)。还有研究发现，PCIF1添加的并不改变基因表达的水平或转录本的稳定性，这也不支持刚开始的观点，即FTO介导的的去甲基化导致的mRNA降解。另外，有研究发现，当FTO敲低时，被认为还能促进那些含有mRNA的翻译效率，但也有一些研究发现了相反的现象，这一过程的调控也有可能是与环境有关。
ALKBH5的作用与底物
ALKBH5是第二个被发现的m6A去甲基化酶。ALKBH5在小鼠的精子形成中发挥了作用，ALKBH5和FTO的表达在不同组织中各异。例如，在小鼠中，Alkhb5主要表达在睾丸，而Fto主要表达在大脑，这可能与它们参与的不同生物学途径有关。在人源细胞系中敲低ALKBH5后，会诱导其靶RNA从细胞核转移到细胞质。几乎所有报道的ALKBH5功能研究都揭示了类似的分子途径，ALKBH5介导某些转录本的3'UTR m6A，其中就包括促进缺氧诱导的HIF依赖的乳腺癌干细胞表型，通过ALKBH5-FOXM1途径调节的胶质母细胞瘤增殖和肿瘤发生，调控雄性生殖细胞中长3'UTR mRNAs的剪接和稳定。
结论与展望
作者在结论部分中讨论了两个问题，第一个是m6A的调控，第二个是m6A未解决的一些问题。
其中m6A的调控功能可能受几个层面的影响，包括以下几个方面
第一，m6A的功能取决于细胞分化和细胞的发育状态。
第二，m6A的功能可能被环境因素或细胞信号触发。
第三，m6A效应子的定位也影响了m6A的功能。
第四，即使是同一个转录本，m6A精确的定位和其它的修饰也会影响其功能。
关于m6A的一些关键问题还没搞清楚，包括以下几个方面：
第一，m6A效应子针对转录本的选择性和m6A位点的选择性是如何实现的？
第二，m6A效应子（包括写入器，擦除器，读取器）是如何整合到不同的生物信号转导与调控过程的？