Week 1 L1-2 DNA结构 DNA复制 聚合酶 校对核酸外切酶 核素掺入法 凝胶电泳 引物延伸 持续合成能力测定

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1.1 介绍

1.2 DNA结构

1.3 DNA复制

快速、完全、精确

1.4 The Chemistry of DNA Replication

DNA聚合酶催化了反应进行
PTJ:primer template junction
引物的3‘端被延长

1.5The DNA Polymerase Active Site

DNA聚合酶催化至少16种反应,但只有一个活性位点

Week 1 L1-2 DNA结构 DNA复制 聚合酶 校对核酸外切酶 核素掺入法 凝胶电泳 引物延伸 持续合成能力测定_第1张图片
DNA双链构成

1.6The Structure of DNA Polymerase

1.7Catalysis by the Fingers of DNA Polymerase

1.8Mistakes by DNA Polymerase

每合成十万对碱基会发生一个错误

1.9校对核酸外切酶Proofreading Exonucleases

修正错误:移除错配的核苷酸

2.1Incorporation Assay核素掺入法

检测DNA活性的方法。检测聚合物的合成情况。

标记dNTP,可以用荧光或放射性标记。在每个时间点加入SDS或EDTA来终止反应。从dNTP中分离DNA并测量其中包含了多少标记的dNTP。那么怎样从dNTP中分离DNA呢?需要用到下面的方法:

2.2Filter Binding Incorporation Assay

把dNTP根据电荷从滤纸上洗脱。因为DNA不容易被洗脱,而dNTP容易被洗脱

2.3Electrophoresis Incorporation Assays凝胶电泳

  • 加热将DNA变性
  • 如果是琼脂糖ararose则添加NaOH,如果是聚丙烯酰胺,则添加尿素。为了防止退火
  • 可以看到产物的长度,但比较慢

2.4引物延伸实验Primer Extension Assay

2.5持续合成能力Processivity

是与聚合物酶相关的能力。与每个聚合物分子结合的酶的反应循环数。

2.6DNA Polymerase Processivity Assay

模板竞争分析,测定持续合成能力。只测量第一次合成的情况。

2.7DNA Populations in Experiments

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