DNA甲基化是一种非常基础且重要的表观修饰，在调控基因表达、转录因子结合和抑制转座子元件中起到关键的作用。
目前，DNA甲基化检测的技术已经比较成熟，例如高通量的WGBS、RRBS、MeDIP-seq、MBD-seq，低通量的BSP、MSP等，其中以WGBS（Whole genome bisulfite sequencing）最为经典。WGBS可以单碱基分辨率尺度下在全基因组范围内鉴定和定量甲基化状态。然而，如何分析WGBS数据通常是一种挑战，涉及众多的分析步骤和注意事项。
以下简要介绍WGBS数据的分析步骤，主要包括：
数据清洗、质量检查和比对
DNA甲基化水平评估
差异甲基化
数据可视化
一、第1步 - trim reads
数据比对之前需要对接头和低质量碱基序列进行去除。
处理工具非常的多，这里以cutadapt为例：
单端数据：
cutadapt -a AGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC \
-m 50 -q 10,10 reads.fastq \
> trimmed_reads.fastq
双端数据：
cutadapt -a AGATCGGAAGA -A CTCTTCCGATC -q 10,10 \
-o trimmed_read1.fastq -p trimmed_read2.fastq \
read1.fastq read2.fastq
压缩数据以节省硬盘存储：
gzip trimmed_reads.fastq
gzip trimmed_read1.fastq trimmed_read2.fastq
详细使用说明参考：http://cutadapt.readthedocs.io/en/stable/
二、第2步 - 数据质量评估
为了评估测序reads的质量，可以使用fastQC来进行，可以轻松的得到reads的质量评估报告。
使用同样非常简单且网页版质量评估简单易懂。
单端数据：
fastqc trimmed_reads.fastq.gz
双端数据：
fastqc trimmed_read1.fastq.gz trimmed_read2.fastq.gz
详细的说明参考：http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/
三、第3步 - 基因组比对
下载物种的基因组序列，并建立基因组索引，通常WGBS建库需要加入内参lambda DNA序列。
首先，需要合并2个基因组序列：
cat genome.fa lambda.fa > genome_lambda.fa
对于基因组比对，这里推荐BS-Seeker2 [https://doi.org/10.1186/1471-2164-14-774]
其与经典的bismark相比，在比对率、精确率等方面均略胜一筹，同时包含甲基化检测套件，使用非常方便，具体信息各位可以阅读原文。
建立参考基因组索引：
python bs_seeker2-build.py -f genome_lambda.fa \
--aligner=bowtie2
随后，reads同索引后的参考基因组进行比对：
单端数据：
python bs_seeker2-align.py -g genome_lambda.fa \
--aligner=bowtie2 \
-u unmapped.fa \
-o mapped.bam \
--bt2-p \
-i trimmed_reads.fastq.gz
双端数据：
python bs_seeker2-align.py -g genome_lambda.fa \
--aligner=bowtie2 \
-u unmapped.fa \
-o mapped.bam \
--bt2-p \
-1 trimmed_read1.fastq.gz \
-2 trimmed_read2.fastq.gz
比对完成后对生成的BAM文件进行排序：
samtools sort -@ -T temp\
-O bam mapped.bam sorted
PCR重复reads是必须要去除的：
这里使用picard tools，samtools也可以但是不是很准确
java -jar picard.jar MarkDuplicates I=sorted.bam \
O=filtered.bam \
M=duplicate_stats.txt \
REMOVE_DUPLICATES=true \
AS=true
四、第4步 - DNA甲基化鉴定
基于全基因组胞嘧啶位置的reads的C/T比对情况进行检测，得到每个胞嘧啶的覆盖深度、序列背景等信息。
python bs_seeker2-
call_methylation.py -i filtered.bam \
--sorted -o \
--db
为了保证甲基化水平评估的准确性，需要对内参DNA进行重亚硫酸氢盐处理的转化率进行计算，需要保证转化率在98%以上。
得到全基因组范围内单个胞嘧啶的甲基化比率后即可对全基因组、染色体、功能区域、重复序列、基因等进行甲基化水平的计算，以进一步研究该物种的甲基化模式。
五、第5步 - 差异甲基化
当进行多个样本比较时，需要进行差异甲基化胞嘧啶（DMC）、差异甲基化区域（DMR）等分析，以寻找样本间特异、特有的甲基化模式。
这里推荐DSS进行差异位点和差异区域的寻找。
首先，需要准备其所需要的文件
格式如下：
例如，只对CpG类型的胞嘧啶进行差异分析：
awk ‘BEGIN {FS=OFS=”\t”} {if ($4 == “CG”) print $1,
$3, $7, $8-$7}’ sample.CGmap > cg_positions.tsv
R软件环境下进行运行：
library(DSS)
column_names <- c(“chr”, “pos”, “N”, “X”)
condition1 <- read.table(‘condition1_cg.tsv’,
header=column_names)
condition2 <- read.table(‘condition2_cg.tsv’,
header=column_names)
experiment <- makeBSseqData(list(condition1,
condition2), c(‘C1’, ‘C1’))
dmlTest <- DMLtest(experiment, group1=c(‘C1’),
+group2=c(‘C2’)
dml <- callDML(dmlTest, delta=0.1,
+p.threshold=0.001)
如此，即可得到差异甲基化的CpG位点。
上述dml对象可以进一步用于更大区域的差异分析，即DMR分析：
dmrs <- callDMR(dmlTest, delta=0.1, minCG=3
+p.threshold=0.001, minlen=50,
+dist.merge=100)
最后，输出上述分析结果到文件：
write.table(dmrs, “cg_dmrs.bed”, sep=”\t”,
+ row.names=FALSE, quote=FALSE)
六、第6步 - 可视化
DMR注释、差异碱基位点、差异甲基化区域等信息均可进行可视化，以直观展示甲基化水平的模式。
常用的可视化工具有IGV、UCSC基因组浏览器、deeptools等。
参考资料：
https://doi.org/10.1038/nature06745
https://doi.org/10.14806/ej.17.1.200
https://doi.org/10.1038/nmeth.1923
https://doi.org/10.1186/1471-2164-14-774
https://doi.org/10.1093/bioinformatics/btp352
https://doi.org/10.1093/nar/gku154
https://github.com/xie186/ViewBS
https://doi.org/10.1093/nar/gku365
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