虽然只有“比对”两个字，但这一步还含有另外四个小步骤：
- s: sort, 排序；
- m: mark duplicate, 标记PCR重复；
- r: realign, indel区域的局部重比对；
- b: base recalibrate, 碱基校正。
其中有很多原理性的东西我自己能理解，但功力还不够把它们讲清楚。一位前辈做过总结，他在他的公众号碱基矿工写了《从零开始完整学习全基因组测序数据分析》系列的5篇推文，是我见过的写重测序最好的教程，我也是看了他的推文才在理解上有了很大的进步。
比对到参考基因组
bwa mem
- -t 设置线程数
- -R 添加header信息，包括lane，测序平台，建库信息，样本编号；最终会显示到bam文件的注释信息中
- -M 标记出最优比对
bwa mem -t 8 -M \
-R "@RG\tID:"${ID}"\tPL:"${PL}"\tLB:"${LB}"\tSM:"${SM} \
${ref} ${fq1} ${fq2} | samtools view -Sb - > ${info}.bam
#需要说明一下，因为这些命令都是我从我的大脚本中截取下来的，所以字符串/文件路径/软件路径都用了变量来表示。
之后就能得到bam文件，比如CL100072545.L01.44.bam。但此时bam中，行与行之间的顺序是乱的，这个顺序是按照fq1和fq2的顺序（它俩reads顺序一致）来的。我们知道，测序是一个随机的过程，所以fq的顺序本身没有什么规律。
排序
这一步就是把bam中行与行的顺序捋顺，染色体号小的在前面，位置号小的在前面。印象中，picard.jar这个软件好像只能用完整的绝对路径。
java -jar picard.jar SortSam I=${info}.bam O=${info}.s.bam SO=coordinate
将PCR导致的重复标记出来
详细解释请看我前面推荐的教程。
java -jar /ifs1/Software/biosoft/picard/picard.jar MarkDuplicates I=${info}.s.bam O=${info}.sm.bam M=${info}.markdup_metrics.txt
或者
${gatk4_path} --java-options "-Xmx10G -Djava.io.tmpdir=./" MarkDuplicates \
-I ${info}.s.bam \
-O ${info}.sm.bam \
-M ${info}.markdup_metrics.txt \
1>${info}.markdup.log 2>&1
上一篇笔记提到，我的数据是两个lane，到这儿就要合并了。
samtools merge ${info2}.sm.bam CL100072545.L01.44.sm.bam CL100072545.L02.44.sm.bam
samtools index ${info2}.sm.bam
#这一步建立索引不要忘了
indel区域的局部重比对
写在前面：
indel=/ifs1/Grp3/huangsiyuan/learn_wes/ref/database/Mills_and_1000G_gold_standard.indels.hg38.vcf.gz
java -jar ${gatk3_path} -T RealignerTargetCreator \
-R ${ref} \
-I ${info2}.sm.bam \
-known ${indel} \
-o ${info2}.IndelRealigner.intervals
java -jar ${gatk3_path} -T IndelRealigner \
-R ${ref} \
-I ${info2}.sm.bam \
-known ${indel} \
-o ${info2}.smr.bam \
--targetIntervals ${info2}.IndelRealigner.intervals
一点小感想：实习以来，接触了人的NGS数据之后，才深深觉得自己之前做植物重测序的时候多么不便利，想找一个变异数据库怎么都找不到。就拿高通量来说，和人相关的研究真的领先别的物种十几二十年了。
碱基质量的校正
写在前面：
snp=/ifs1/Grp3/huangsiyuan/learn_wes/ref/database/dbsnp_146.hg38.vcf.gz
indel=/ifs1/Grp3/huangsiyuan/learn_wes/ref/database/Mills_and_1000G_gold_standard.indels.hg38.vcf.gz
${gatk4_path} --java-options "-Xmx20G -Djava.io.tmpdir=./" BaseRecalibrator \
-R ${ref} \
-I ${info2}.smr.bam \
--known-sites ${snp} \
--known-sites ${indel} \
-O ${info2}.recal.table \
1>${info2}.recal.log 2>&1
${gatk4_path} --java-options "-Xmx20G -Djava.io.tmpdir=./" ApplyBQSR \
-R ${ref} \
-I ${info2}.smr.bam \
-bqsr ${info2}.recal.table \
-O ${info2}.smrb.bam \
1>${info2}.ApplyBQSR.log 2>&1
像这一步，植物的流程里面基本不会有，因为没有--known-sites。
在这之后就能生成我们想要的bam文件了：
-rw-r--r-- 1 huangsiyuan grp3 6.6M Oct 11 20:02 CL100072545.44.smrb.bai
-rw-r--r-- 1 huangsiyuan grp3 21G Oct 11 20:02 CL100072545.44.smrb.bam
（r和b这两步的索引文件bai是自动生成的，不需要额外创建。）
gatk4是今年3,4月份出的，生信技能树的Jimmy老师分享过最新的教程，我以后也会尽量用gatk4。前面realign那一步我用的gatk3，是因为没有在gatk4中找到相应的模块。