CRISPR-Cas9基因编辑1--背景介绍及gRNA设计(上)

简介和前期文章

我对之前的所有教程进行了再次详细的总结

前言:

每当我们接触新事物时,都忍不住问如下图所示之哲学三问(当然有时候问的是,这是什么?可以吃吗?怎么做?):


CRISPR-Cas9基因编辑1--背景介绍及gRNA设计(上)_第1张图片
CRISPRCas91.png

由于我们是实验教程,因此便不再详细介绍CRISPR/Cas9的细节,在这里只做一个大概的介绍,主要材料为最近整理的思维导图。温馨提示:如果不需要了解背景知识,可直接跳到第4点,实验方案正文部分。

1. 是何物?

1.1 CRISPR
CRISPR是古细菌及细菌抵抗病毒的机制,当病毒攻击细菌时,细菌将该病毒的部分DNA整合到自身基因内组成CRISPR,当下次该病毒再次来袭之时,CRISPR转录的crRNA可通过碱基互补识别外源性DNA并激活Cas核酸内切酶的DNA切割活性,由此杀伤病毒。
1.2 CAS即为CRISPR相关的核酸内切酶,有多个亚型
1.3 CRISPR/Cas系统

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### 2. 有何用
2.1 在细菌中主要抵抗外来病毒的侵袭,略
2.2 在实际应用中,设计特异性的CRISPR识别片段,可帮助靶向编辑基因,具体可见下图,详细机制可参考张峰组论文:[Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system]
(https://www.nature.com/articles/nprot.2013.143)

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3. 如何用

在这里我们使用CRISPR/Cas9直接敲除为例,介绍实验方案和过程,如想更详细了解,可查阅上文提到的张峰组论文:[Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system]
(https://www.nature.com/articles/nprot.2013.143)

根据上文我们已知,CRISPR/Cas系统一共有CRISPR和Cas9两个部件组成,因此:


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4. 实验方案正文

CRISPR/Cas9的实验方案有很多种,但最终目的都是一样的,即将靶向结合到目的基因的sgRNA及Cas9核酸内切酶导入到细胞中,达到基因编辑的效果

根据sgRNA及Cas9的产生、投递方式的不同,有诸多不同的实验方案。在这里我的方案是,将sgRNA插入到含有Cas9的质粒中,将质粒转入细胞,让细胞同时表达sgRNA及Cas9,达到基因编辑的效果

4.1 确定靶基因--因人而异

4.2 gRNA设计(特异性识别靶基因的序列)-- 0.5 h~半天

这里以非常常见的P53基因为例子,过一遍gRNA设计流程。

(1)NCBI网页下载P53基因序列

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点击GenBank

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下载序列

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(2) 用SnapGene软件打开序列, 分析敲除位点。

敲除所有剪接体共有的外显子序列

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鼠标悬停目标外显子,查看详细信息,得知第一个segment(片段)是从12417-12498,一共82 bp;在Sequence中查看,复制一整个segment的碱基序列

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segment碱基序列atggccatctacaagcagtcacagcacatgacggaggttgtgaggcgctgcccccaccatgagcgctgctcagatagcgatg

(3)设计sgRNA

一般选择网页工具设计即可: https://zlab.bio/guide-design-resources (张峰实验室),打开网页,选择网页工具--博德研究所

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粘贴序列,选择化脓性链球菌(NGG)即Cas9,人类基因组

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查看结果

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对结果进行判断,选择合适的序列:

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![img]

小彩蛋

快捷方案:可以购买已经合成好的sgRNA+质粒(土豪请随意)

寻找现成的CRISPR/Cas9敲除细胞系,在信息介绍中找到公司使用的gRNA,例如:

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以上我们完成了对CRISPR/Cas9的简单了解及gRNA的在线设计,由于篇幅较长,将在下一次补充gRNA设计之后的验证事项和质粒构建的方案,感谢关注,继续学习,拜拜~

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