数据的质量控制软件——fastQC
本文转载自“计算表观遗传学”,己获授权。
目前的高通量测序技术可以在单次运行中产生数亿个序列。在分析此序列以得出生物学结论之前，应该执行一些简单的质量控制检查，以获得较好的原始数据，并且确保数据中没有任何问题或偏差，本文就来介绍一款简单常用的质量检测工具fastQC。
大多数测序平台会生成一个QC报告作为其分析流程的一部分，但这通常只能识别由测序仪本身产生的问题。FastQC的开发和维护主要由Babraham Bioinformatics实验室负责，旨在提供一个可以发现来自测序平台或起始文库问题的QC报告。
FastQC有两种模式运行。它可以作为独立的交互式应用程序运行，用于临时分析少量的Fastq文件，也可以以非交互模式运行，用于集成到较大的分析流程中，用于并行批量处理大量文件。
1 下载和安装
FastQC是用java写的，所以需要一个Java Runtime Environment，还需要Picard BAM/SAM库，软件支持多个系统平台，包括Windows版、Linux和MacOS。本文使用Linux环境。
FastQC官网下载：http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/
这里我们选择下载编译好的程序，上传软件安装包到Linux服务器，使用unzip命令来进行解压缩。然后进入解压缩文件，fastqc文件即是主程序，使用chmod u+x 命令修改为可执行权限。
如果觉得官网下载安装太麻烦，推荐conda安装最方便：
conda install fastqc，一句话搞定。
关于conda软件的安装和使用，详见下文：
Nature Method：Bioconda解决生物软件安装的烦恼
1 使用的命令
我们在服务器上用命令行来运行fastQC：
最简单的使用方法：fastqc *.fastq.gz，即可开始对所有测序数据进行评估。下面还有完整命令行规则和参数说明
fastqc[-o output dir] [--(no)extract] [-f fastq|bam|sam] [-c contaminant file]seqfile1 .. seqfileN
-o 用来指定输出文件的所在目录，生成的报告的文件名是根据输入来定的，注意是不能自动新建目录的。输出的结果是.zip文件，默认不解压缩，命令里加上--extract则压缩。
-f 用来强制指定输入文件格式，默认自动检测。支持fastq、bam、sam极相应的gz压缩格式
-c 污染物选项，输入的是一个文件，格式是Name[Tab] Sequence，#开头的行是注释，里面是可能的污染序列，如果有这个选项，FastQC会在计算时候评估污染的情况，并在统计的时候进行分析。
-q 会进入沉默模式，指定这个选项的时候，程序不会实时报告运行的状况，即不出现下面的提示：
Started analysis of target.fq
Approx 5% complete for target.fq
Approx 10% complete for target.fq
1 fastQC报告解读
打开生成的HTML格式的结果报告，如下图所示：
Summary 概要
本部分就是整个报告的目录，整个报告分成若干个部分。合格会有个绿色的对勾，警告是黄色叹号，不合格是红叉。
Basic Statistics 基本信息
Encoding指测序平台的版本和相应的编码版本号，可推测是Phred 33 或是Phred 64 质量分数的编码方式。
Total Sequences输入文本的reads的数量。
Sequence length 测序的长度
%GC 是我们需要重点关注的一个指标，这个值表示的是全部序列中的GC含量，这个数值一般是物种特异的，比如人类基因组就是42%左右。
用箱式图的方式展示数据质量，图中X轴每1个位置，都是该位置的所有序列的测序质量的统计。纵轴是质量得分，Q =-10*log10(p)，p为测错的概率。所以一条reads某位置出错概率0.01时，其quality就是20。横轴是测序序列的位置。蓝色线是各个位置的平均值的连线。一般要求此图中，所有位置的10%分位数大于20,也就是常说的Q20过滤。
所以上面的这个测序结果质量很好。如果任何碱基质量低于10,或者是任何中位数低于25报警，如果任何碱基质量低于5,或者是任何中位数低于20报错。
这一模块是检查在测序平台上，reads中每一个碱基位置在不同的测序小孔之间的偏离度，偏离度越高，碱基质量越差。纵轴表示测序小孔，蓝色表示低于平均偏离度，越红则说明偏离平均质量方差越多，也就是说质量越差，本图中都是蓝色表明质量很好。如果出现质量问题可能是短暂的，如有气泡产生，也可能是长期的，如在某一小孔中存在杂质。偏离度小于平均值2以上报警，偏离度小于平均值5以上不合格。
这是为了检测一部分质量特别差的reads，如果有则会在图上出现多个峰，如在测序仪边缘的reads。纵轴是reads数目，横轴是质量分数，代表不同Phred值对应了多少的reads。
本图中，测序结果主要集中在高分中，证明测序质量良好。当峰值小于27（错误率0.2%）时警报，当峰值小于20（错误率1%）时不合格。
展示碱基含量分布，它根据碱基的位置对每个位置上的A,C,G,T的含量进行统计，横轴为位置，纵轴为百分比。正常情况下四种碱基的出现频率应该是接近的，而且没有位置差异。因此好的样本中四条线应该平行且接近。当部分位置碱基的比例出现bias时，即四条线在某些位置纷乱交织，往往提示我们有overrepresented sequence的污染。当所有位置的碱基比例一致的表现出bias时，即四条线平行但分开，往往代表文库有bias (建库过程或本身特点)，或者是测序中的系统误差。当任一位置的A/T比例与G/C比例相差超过10%发出警报，超过20%则数据不合格。
图中红色曲线是实际的测序GC含量分布图，而蓝色曲线则是理论分布（正态分布，不过均值不一定都是50%，而是由平均GC含量推断的）。如果红色曲线形状存在比较大的偏差，往往是由于文库污染造成的。红色曲线越平滑越好，越接近蓝色曲线越好。形状接近正态但偏离理论分布的情况提示我们可能有系统偏差。偏离理论分布的reads超过15%时发出警报，超过30%时报不合格。
纵轴是百分含量，横轴是read的位置，当测序仪不能确切地测定出某一个碱基时就会标注为N，正常情况下N的比例是很小的，所以图上常常看到一条直线。当看到有峰时，说明测序出了问题。当任意位置的N的比例超过5%警报超过20%不合格。
每次测序仪测出来的长度在理论上应该是完全相等的，但是总会有一些偏差，如此图中，40bp是主要的，但是还是有少量的39和41bp的长度，不过数量比较少，不影响后续分析，当测序的长度有很大不同时，则表明测序仪在此次测序过程中产生的数据不可信，但对于某些测序平台，具有不同的read长度是完全正常的。当reads长度不一致时警告，当有长度为0的read时不合格。
横轴为reads重复的次数，纵轴为重复次数对应的reads占不重复的reads的比例。测序深度越高，越容易产生一定程度的duplication，这是正常的现象，但如果duplication的程度很高，那么表明存在富集的偏好（enrichment bias）（比如：测序过程中的PCR重复，转录组测序中某些基因表达量高），序列重复比例越高，则表明实际有用的序列越少。图中有蓝红两条线，蓝色线表示的是文件中所有的序列中duplicate程度的分布，红色线表示的是去冗余之后的序列，含量表示的在全部序列都考虑时不同冗余程度的序列所占的比例。重复reads占总数的比例大于20%时警报，大于50%时不合格。
如果有某个序列大量出现，就叫做over-represented。标准是占全部reads的0.1%以上。但是因为用的是Duplicate sequences前200,000条数据，所以有可能over-represented reads不在里面，参考意义不大。
此图衡量的是序列中两端adapter的情况，如果在fastqc分析的时候-a（指定含adapters序列文件）选项没有内容，则默认使用图例中的通用adapter序列进行统计。含有adapter超过所有reads的5%的警告，超过10%不合格。
这个图统计的是，在序列中某些特征的短序列重复出现的次数，我们可以看到11-14bp的时候图例中的短序列出现了非常多的次数，一般来说，出现这种情况，要么是adapter没有去除干净，而又没有使用-a参数；要么就是序列本身可能重复度比较高，如建库PCR的时候出现了bias。
更多详细信息参考fastQC使用说明：http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/
猜你喜欢
10000+：菌群分析 宝宝与猫狗 梅毒狂想曲 提DNA发Nature Cell专刊 肠道指挥大脑
系列教程：微生物组入门 Biostar 微生物组 宏基因组
专业技能：学术图表 高分文章 生信宝典 不可或缺的人
一文读懂：宏基因组 寄生虫益处 进化树
必备技能：提问 搜索 Endnote
文献阅读 热心肠 SemanticScholar Geenmedical
扩增子分析：图表解读 分析流程 统计绘图
16S功能预测 PICRUSt FAPROTAX Bugbase Tax4Fun
在线工具：16S预测培养基 生信绘图
科研经验：云笔记 云协作 公众号
编程模板: Shell R Perl
生物科普: 肠道细菌 人体上的生命 生命大跃进 细胞暗战 人体奥秘
写在后面
为鼓励读者交流、快速解决科研困难，我们建立了“宏基因组”专业讨论群，目前己有国内外2200+ 一线科研人员加入。参与讨论，获得专业解答，欢迎分享此文至朋友圈，并扫码加主编好友带你入群，务必备注“姓名-单位-研究方向-职称/年级”。技术问题寻求帮助，首先阅读《如何优雅的提问》学习解决问题思路，仍末解决群内讨论，问题不私聊，帮助同行。
学习16S扩增子、宏基因组科研思路和分析实战，关注“宏基因组”
