nanopore测序技术专题（五）：建库测序

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所谓建库测序就是对测序的DNA进行一些处理，是一个“格式化”的过程，需要将DNA处理成固定的模式才可以。例如需要给原始的DNA加上A碱基，接头，测序引物，index或者barcode标签等。建库测序是DNA测序过程中非常重要的一个环节，可以说直接影响到测序质量，建库效果不好，测序质量不可能好。

DNA提取
纳米孔可以测序DNA本身长度的读长，这就需要原始DNA具有的长度。因此，在测序之前能够提取到相对完整的DNA比较重要。由于不同物种DNA提取方法不同，这就需要依据一些不同样本提取的经验方法。例如植物基因组具有细胞壁，而且由于次级代谢物如多糖和多酚含量很高，很难从植物细胞中获得纯净、优质的高分子量（HMW）DNA。这种污染物的存在会对下游分析应用产生很大影响，也是测序产出低的最常见原因之一。nanopore社区提供了一个不同物种提取的经验方法交流社区，可以在里面找到适合自己样品提取的方法。

提取出来的DNA对浓度和质量的要求与其他分子生物学实验的要求差不多，尽量保证更长的片段，不要有RNA或者蛋白质的污染。
1、如何评估DNA质量？
可以使用Nanodrop仪器进行检验。
DNA ：A260/A280 = ~1.8 ，A260/A230=~2.0-2.2
RNA : A260/A280 = ~2.0 ，A260/A230=~2.0-2.2

2、评估片段大小：
使用Agilent Bioanalyzer/Tapestation，PFGE，fragment analyzer，FEMTO pulse:

nanopore建库
传统的二代测序，以illumina测序为例，一般需要经过随机打断，加A碱基，加测序引物，加index或者barcode，加adapter，扩增等过程。因为nanopore测序让DNA分子穿过纳米孔，通过读取电信号来识别碱基，因此建库不需要繁琐过程，这样不仅可以提高建库的速度，也能减少引入的误差，一般来说操作步奏越少，自然引入的误差也就更少。nanopore建库主要是需要给待测DNA两侧先加上A碱基，使平末端变成粘性末端，然后再加上Y接头以及马达蛋白。

是否需要PCR
二代边合成边测序的方案中，需要大量使用的PCR操作，包括前期加接头，cluster等步骤，都需要大量的PCR，由于PCR的长度限制，也就导致了为什么sanger测序与illumina测序不能进行长读长的测序，例如超过1000bp读长。而nanopore测序过程中可以完全无需PCR，因此可以测序超长读长，而且PCR也会带来一些扩增的偏向性，给数据引入一些误差。

不过根据不同的研究目的，有些过程也是需要使用PCR的，例如原始DNA量太少，就需要进行扩增，或者像转录本本身长度不是特别长，需要反转录成cDNA，可以进行PRC。又或者对16S进行测序，无需太多数据量，这种情况下就需要进行混样建库，这还是需要使用到PCR，目前nanopore也支持混样建库，最多支持96个样品。可以根据不同的研究目的选择合适的建库方法。

自动化建库设备VolTRAX
目前，nanopore发布了VolTRAX，一种可实现快速样品制备的小型自动化设备，VolTRAX可以进行自动化的文库制备，用一个小型装置取代了一系列实验室设备。

该装置可以进行不论简单还是复杂的准备工作用于纳米孔分析，将提取到的DNA与建库试剂按照软件指示进行操作，就可以完成建库工作，然后将建库后的DNA搜集，用于下一步测序即可，VolTRAX的介绍视频见公众号。

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