bulk RNA-seq canonical workflow（salmon和subread）

References：

1.RNA-seq(4)：Hisat2+FeatureCounts+DESeq2流程+作图！

https://pzweuj.github.io/2018/07/18/rna-seq-4.html

2.一个植物转录组项目的实战

http://www.bio-info-trainee.com/2809.html

3.RNA_seq（1）植物转录组差异基因分析简单练习

https://www.jianshu.com/p/7146d5c41294

Part I II 基本是照着做的，脚本会有一丢丢修改，之后吃饱了再弄吧

Part III:Featurecounts —>构建dds object ，获得expression matrix

featureCounts完成生物学定量

featureCounts是一款可以进行生物学定量的软件，它集成在subread的package里了

需要提供gtf格式的注释或者SAF格式的注释;

>gff3='/public/study/mRNAseq/tair/Arabidopsis_thaliana.TAIR10.28.gff3.gz'

>gtf='/public/study/mRNAseq/tair/Arabidopsis_thaliana.TAIR10.28.gtf.gz'

>featureCounts='/trainee/home/yjxiang/tools/subread-1.6.2-source/bin/featureCounts'

>nohup$featureCounts-T 5 -p -t exon -g gene_id -a$gtf-o /trainee/home/yjxiang/practice/subread_workflow/counts_out/counts_id.txt/trainee/home/yjxiang/practice/subread_workflow/mapping_out/*.bam & #挂在后台即便网络不稳也可执行，在提交程序和前台运行之间的选择！

会得到两个文件，一个是结果count_id.txt，一个是结果的count_id.txt.summary。

subread/featurecount 获得的count_id.txt 

DESeq2差异基因分析

First step:获取表达矩阵和分组信息

> library(DESeq2)

## 数据预处理

> sampleNames<-c('ERR1698194','ERR1698195','ERR1698196','ERR1698197')# 抽取前四列sample

>data <- read.table("count_id.txt", header=TRUE, quote="\t", skip=1)

>names(data)<-c('Geneid','Chr','Start','End','Strand','Length','ERR1698194','ERR1698195','ERR1698196','ERR1698197','ERR1698198','ERR1698199','ERR1698200','ERR1698201','ERR1698202','ERR1698203','ERR1698204','ERR1698205','ERR1698206','ERR1698207','ERR1698208','ERR1698209')#对 第一行重命名

# 前六列分别是Geneid Chr Start End Strand Length# 我们要的是count数，所以从第七列开始

>names(data)[7:10] <- sampleNames

>countData<-as.matrix(data[7:10])#第七列开始是每个sample对应的feature的counts,[前处sampleName命令有误，与此提取数据不match]

#将数据转换为矩阵格式

用featureCounts定量得到的counts_id.txt ，经过格式处理之后得到表达矩阵：countdata:第一列是基因ID，之后的列都是样本ID

每一行代表不同的基因在不同样本中的表达量.

> rownames(countData)<-data$Geneid

> database <- data.frame(name=sampleNames)

#database设置分组信息

>database <- data.frame(name=sampleNames, condition=c('a','a','b','b'))

>rownames(database) <- sampleNames#database是一个二维矩阵，赋予列名

>colnames(countData)<-NULL

##Second step: 构建dds对象

>dds <- DESeqDataSetFromMatrix(countData, colData=database, design= ~ condition)

> dds

class: DESeqDataSet 

dim: 33602 4 

metadata(1): version

assays(1): counts

rownames(33602): AT1G01010 AT1G01020 ...

  ATCG01300 ATCG01310

rowData names(0):

colnames(4): ERR1698194 ERR1698197

  ERR1698204 ERR1698207

colData names(2): name condition

> dds <- dds[ rowSums(counts(dds)) > 1, ]

## 使用DESeq函数估计离散度，然后差异分析获得res对象

> dds<-DESeq(dds)#对原始的dds进行标准化

>resultsNames(dds)#查看结果名称

>res <- results(dds)#用results函数提取结果，并赋值给res变量

> summary(res) #查看结果

out of 21129 with nonzero total read count

adjusted p-value < 0.1

LFC > 0 (up)       : 76, 0.36%

LFC < 0 (down)     : 115, 0.54%

outliers [1]       : 0, 0%

low counts [2]     : 3687, 17%

(mean count < 12)

[1] see 'cooksCutoff' argument of ?results

[2] see 'independentFiltering' argument of ?results

>write.csv(res, "res_des_output.csv")

>resdata <- merge(as.data.frame(res), as.data.frame(counts(dds, normalized=TRUE)),by="row.names",sort=FALSE)

>write.csv(resdata, "all_des_output.csv", row.names=FALSE)

##Third step:提取结果并绘制火山图

result.csv

Part VI: Drawing

> #提取差异基因!!!

> res <- res[order(res$padj),]

> resdata <-merge(as.data.frame(res),as.data.frame(counts(dds,normalize=TRUE)),by="row.names",sort=FALSE)

> deseq_res<-data.frame(resdata)

> up_diff_result<-subset(deseq_res,padj < 0.05 & (log2FoldChange > 1)) #提取上调差异表达基因

> down_diff_result<-subset(deseq_res,padj < 0.05 & (log2FoldChange < -1)) #提取下调差异表达基因

> write.csv(up_diff_result,"D:\\R.3.5.3\\上调_diff_results.csv") #输出上调基因

> write.csv(down_diff_result,"D:\\R.3.5.3\\下调_diff_results.csv") #输出下调基因

1.Valcano 火山图 可以非常直观且合理地筛选出在两样本间发生差异表达的基因

R script：

> library(ggplot2)

> # 这里的resdata也可以用res_des_output.csv这个结果重新导入哦。

> # 现在就是用的前面做DESeq的时候的resdata。

> resdata$change <- as.factor(

+     ifelse(

+         resdata$padj<0.01 & abs(resdata$log2FoldChange)>1,

+         ifelse(resdata$log2FoldChange>1, "Up", "Down"),

+         "NoDiff"

+     )

+ )#确定统计学显著性

> valcano <- ggplot(data=resdata, aes(x=log2FoldChange, y=-log10(padj), color=change)) + 

+     geom_point(alpha=0.8, size=1) + 

+     theme_bw(base_size=15) + 

+     theme(

+         panel.grid.minor=element_blank(),

+         panel.grid.major=element_blank()

+     ) + 

+     ggtitle("DESeq2 Valcano") + 

+     scale_color_manual(name="", values=c("red", "green", "black"), limits=c("Up", "Down", "NoDiff")) + 

+     geom_vline(xintercept=c(-1, 1), lty=5, col="gray", lwd=0.5) + 

+     geom_hline(yintercept=-log10(0.01), lty=5, col="gray", lwd=0.5)

> valcano

2.PCA 主成分分析，把数据降维后进行分析，pc1和pc2是对整个数据集解释程度贡献率第一和第二的cluster，主成分。

R script:

> # library(ggplot2)

> rld <- rlog(dds)

> pcaData <- plotPCA(rld, intgroup=c("condition", "name"), returnData=T)

> percentVar <- round(100*attr(pcaData, "percentVar"))

> pca <- ggplot(pcaData, aes(PC1, PC2, color=condition, shape=name)) + 

+     geom_point(size=3) + 

+     ggtitle("DESeq2 PCA") + 

+     xlab(paste0("PC1: ", percentVar[1], "% variance")) + 

+     ylab(paste0("PC2: ", percentVar[2], "% variance"))

> pca

3.heatmap:热图实现基因表达模式可视化的需求。 4个样本的表达差异并不明显，因为我是从同一批次中随机抽取的无差别处理的4个samples。

Rscript:

> library(pheatmap)

> select <- order(rowMeans(counts(dds, normalized=T)), decreasing=T)[1:1000]

> nt <- normTransform(dds)

> log2.norm.counts <- assay(nt)[select,]

> df <- as.data.frame(colData(dds)[, c("name", "condition")])

> pheatmap(log2.norm.counts, cluster_rows=T, show_rownames=F, cluster_cols=T, annotation_col=df, fontsize=6)

>