DAY7 一二三代测序，重一二代测序原理，三代略看，必备words

image.png

一代测序：Sanger测序原理

• 简单概述 双脱氧终止反应法，聚合酶延伸链 (由于ddNTP的2’和3’都不含羟基，其在DNA的合成过程中不能形成磷酸二酯键，因此可以用来中断DNA合成反应)
• 设置四个反应体系1-4，分别加入引物、DNA聚合酶、四种dNTP、一定比例的ddNTP（带有放射性标记）例如1中是ddATP，它就负责测定T碱基的位置；
• 之后大批量的核苷酸反反复复的结合，把所有的位点都结合
• 最后利用凝胶电泳和放射自显影只能看到带有荧光标记的ddNTP，先利用电泳条带前后关系确定下他们的排列顺序，再用ATCG关系反转一下
• 优点：准确度很高，99.999%
• 缺点 一代最长能测1000bp，再多了就要重头开始一遍导致成本高；另外它一次只测一条，也就是所谓的通量低。

二代测序NGS步骤与原理(先看必备words,见下)

三平台：Roche公司的454技术、illumina公司的Solexa/Hiseq技术(占主要市场，PE（Pair End双端）测序原理)、ABI公司的SOLID技术
双端测序原理：如下

1. 建DNA文库
   超声打断，用酶补平为平末端，再在两端加上互补配对的adapter(接头)，再通过PCR扩增达到一定浓度，构成单链DNA文库
   adapter修饰，图片来自生信星球**
   
   

   image.png

2. 上样

• 步骤：建好的文库中的待测序列→测序就在flowcell进行，在特异的化学试剂作用下，强力随机地附着在lane上，与上面的短序列配对，吸附住冲过来的DNA,再在表面进行桥式PCR扩增
• 注意：
• • lane上有哪两种接头：lane上随机分布两种接头，p5‘（与P5互补），P7（与P7'互补）
• • 待测序列含有哪两种接头: 自带了p5接头和p7接头
• • lane与lane之间一般不会相互影响，也就是说一般不会出现lane1固定的DNA又与lane2结合。
• • 序列只能一开始是利用p5接头互补，因为p7接头和lane是一样的

3. 桥式PCR

• 第一轮扩增模版：flowcell表面固定的序列(模版链)，与lane接头配对产生了补成双链，后来强碱试剂作用下两条互补链被分开，模版链被冲走，但是互补链稳固定在lane上。接下来就要对互补链p5‘- p7‘ 进行操作

• 去杂：加入NaOH强碱性溶液使双链DNA变性；模板链会被洗脱
  图片补充来自生信星球
  

  

  image.png

• 桥式形成： 加入缓冲溶液，互补链的p7‘和lane上的p7互补（但还是一个lane中的），形成了桥的样子
  

  

  image.png

• 桥式PCR： PCR弯成桥状，一轮桥式扩增一倍
  

  

  image.png

• 循环： 大约35个循环后，最终每个DNA片段都将在各自的位置上集中成束，称为cluster，这是一群完全相同的序列。目的在于实现放大单一碱基的信号强度，满足后期测序需求

• 解链： 桥式PCR完成后，形成了很多的桥形的互补双链，再次强碱解链。这一次不再进行复制，而是利用一种酶--甲酰胺基嘧啶糖苷酶（Fpg）选择性的切掉lane 上p5‘ 连接的链，只留下了与lane p7连接的链，这就是Forward Strand（正链，相对应的reverse strand 是负链）
  

  

  image.png

4. 测序（边合成变测序）

• 4①双端测序之Forward Strand

• • primer结合到靠近p5的sequencing primer binding site1上(结合第一张图片看)，再加入特殊的dNTP(它的3‘ 羟基被叠氮基团替代，每次只能添加一个dNTP；还含有荧- 光基团能激发不同颜色)；
• • 在dNTP被添加到合成链上后，所有未使用的游离dNTP和DNA聚合酶会被洗脱掉；
• • 再加入激发荧光缓冲液，激光激发荧光信号，光学设备记录荧光信号的记录，再转化为测序碱基
• • 再加入化学试剂淬灭荧光信号并使dNTP 3’ 叠氮基团变成羟基，这样能继续向下进行再加一个，并且保证这个不再发出荧光。如此重复直至所有链的碱基序列被检测出。得到了Forward Strand序列

• 4② Index测序
  index1 primer和链上的index1 互补配对，进行index1的检测，测完后，洗脱产物，得到index1 的序列。之后再桥式，再进行index2的。图片来自生信星球
  

  

  image.png

• 4③双端测序之Reverse Strand： 洗脱掉index2 产物后，还是一个桥式扩增得到双链，再变性得到原始Forward strand 和 新的Reverse Strand， 除去测完的Forward strand。然后和测Forward一样，也是先连接primer，只是连接的位点是Primer Binding Site2，测完后得到reverse strand序列

• 二代优点：一个循环就能测定flowcell上成千上万的cluster，这就实现了高通量；illunima一次只添加一个dNTP，确实能够保证准确测量同聚物的长度问题

• 二代缺点：illumina会限制合成的链的长度（原因在于测序长度越长，杂信号越多）

三代测序

• 单分子实时DNA测序，不需要经过PCR扩增，实现了对每一条DNA分子的单独测序，超长读长（可达二代测序的100倍以上），可直接检测表观修饰
• 目前以Pacific Biosciences公司的SMRT技术和Oxford Nanopore Technologies公司的纳米孔单分子技术为主流
• 特点
  缺：准确率低
  优：读长长

必备words（需不断更新）

flowcell： 测序反应的载体/容器，1个flowcell有8个lane
lane： 测序反应的平行泳道，试剂添加、洗脱等过程的发生位置
tile： 每次荧光扫描的位置，肉眼是看不到的
双端测序： 可能序列比较长有四五百bp，两边各测120-150bp
junction： 双端测序中间一些没有测到的区域
flowcell构造：一个lane包含两列（swath），每一列有60个tile，每个tile会种下不同的cluster，每个tile在一次循环中会拍照4次（每个碱基一次）
sequence by synthesis, SBS 边合成变测序
同聚物：就是3‘端一个一个加dNTP聚合而成的聚合物，因为还带接头，所以不能直接说成DNA分子

一二三代测序总结与对比（引自生信星球）

二代测序主要平台有：
　1.罗氏454公司的GS FLX sequencer
　2.Illumina solexa genome analyzer
　3.ABI公司的SOLiD sequencer

image.png

可以参考的链接
测序的世界(上面内容主要来自此，不理解的看着)
初涉测序
测序技术原理及常用数据格式简介
其他待看
DNA 测序技术的发展：第三代测序法
测序发展史：150年的风雨历程
名词结构化（有关于NGS组学的一些结构，但不太懂）