易基因｜典型案例：MeRIP-seq综合分析肺腺癌中的转录组m6A甲基化组
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2022年8月11日，南方科技大学王玉琨教授团队以“Comprehensive Analysis of the Transcriptome-wide m6A Methylome in Lung Adenocarcinoma by MeRIP Sequencing”为题在《Frontiers in Oncology》杂志上发表研究论文，通过MeRIP-seq和对应的转录组测序（RNA-seq）联合分析验证了m6A甲基化修饰与肺腺癌（LUAD）进展之间的强关联。
标题：Comprehensive Analysis of the Transcriptome-wide m6A Methylome in Lung Adenocarcinoma by MeRIP Sequencing（通过MeRIP-seq全面分析肺腺癌转录组范围的m6A甲基化组）
时间：2022.08.11
期刊：Frontiers in Oncology
影响因子：IF 5.738
技术平台：MeRIP-seq（m6A-seq）、mRNA-seq
样本：3个肺腺癌（LUAD）样本和3个癌旁正常组织样本，共6个样本
实验：MeRIP-seq、mRNA-seq、甲基化组与转录组关联分析、结合公共数据库分析、实验验证（qPCR、RIP-qPCR）
摘要：
N6-甲基腺苷（m6A）是真核mRNA上最丰富的修饰。越来越多的证据表明m6A在肿瘤进展中起关键作用，因此分析肺腺癌（lung adenocarcinoma,LUAD）转录组范围内的m6A修饰非常重要。本研究采集三对LUAD组织样本和癌旁正常组织样本，利用甲基化RNA免疫沉淀测序（MeRIP-seq）和RNA测序（RNA-seq）来鉴定肿瘤和癌旁正常组织之间的差异m6A修饰。共鉴定出4041个异常m6A peaks，其中1192个m6A peaks上调，2849个m6A peaks下调，失调的m6A peak基因在癌症、Rap1信号通路和胰岛素抵抗通路中富集。
对MeRIP-seq和RNA-seq数据进行联合分析，鉴定出612个m6A peaks和RNA表达异常调控基因。KEGG分析鉴定出612个基因在癌症相关信号通路中富集，包括cGMP-PKG信号通路和Rap1信号通路。GSEA富集分析表明，这些基因在细胞周期相变、细胞分裂、细胞对DNA损伤刺激响应和染色体组织中富集。
为进一步研究差异m6A修饰基因与LUAD患者临床参数之间的关系，作者搜索了癌症基因组图谱（TCGA）并鉴定了2个与LUAD患者预后和诊断相关的基因——FCRL5和GPRIN1。同时，在GEPIA2数据库中发现GPRIN1和m6A reader YTHDF1之间呈正相关，证明了YTHDF1与GPRIN1 mRNA结合并调控其表达。本研究结果表明，m6A修饰在LUAD的进展和预后中起重要作用，可能是未来LUAD患者潜在的新治疗靶点。
结果图形
（1）LUAD 中的 m6A 甲基化图概述
图1：LUAD中m6A甲基化特征
- 排名前三的m6A motif。
- m6A peak在正常和肿瘤组织中的分布图。
(C, D) 差异m6A peak的分布图。
(E)直方图显示正常和肿瘤样本之间 m6A 富集的变化。(F)显著差异m6A peak 火山图。
(G)每个 mRNA 变化的 GGAC 序列的分布。
(H)差异 m6A peak在染色体上的分布。
表1：LUAD组织与正常组织的前20个m6A甲基化peaks
（2）含有m6A基因参与重要的生物学过程和通路
图2：差异 m6A 基因的 GO 功能富集和 KEGG 通路富集
- 下调m6A peak基因的前 10 GO类别图。
- 上调m6A peak基因的前 10 GO类别图。
- 下调m6A peak基因的前 10 KEGG 通路图。
- 上调m6A peak基因的前 10 KEGG 通路图。
图3：肿瘤和正常组织之间的差异甲基化基因GO富集分析
（3）转录组图谱及MeRIP-seq与RNA-seq数据的联合分析
图4：MeRIP-seq与RNA-seq数据的联合分析
- 差异表达基因火山图。
- 差异表达基因热图。
- 四象限图显示了 m6A 修饰和 RNA 水平均发生显著变化的基因分布。
- m6A 修饰和 mRNA 水平均发生显著变化基因的前 10 GO 类别图。
- m6A 修饰和 RNA 水平均发生显著变化基因的前10 KEGG通路 图。
(F、G、H、I）m6A 修饰和 RNA 水平均发生显著变化基因的GSEA富集图。
表2：肿瘤组和正常组m6A-seq&RNA-seq的前20个差异基因
（4）鉴定含有m6A修饰的2个基因与LUAD患者的临床参数相关
图5：m6A修饰调控的基因表达与TCGA数据库中临床参数的关系
- 本研究中的基因与 TCGA 数据库的交集。
- 前20 个基因的单变量 Cox 回归分析。
（C、D）分别为 GPRIN1 和 FCRL5 的总体生存曲线。(E) GPRIN1 表达与 N 的关系。
(F, G, H) FCRL5 表达与 M、N 和临床分期的关系。
(I, J) GPRIN1 和 FCRL5 的ROC曲线（N：淋巴结转移；M：远处转移。）
表3：肿瘤组和正常组中m6A-seq＆RNA-seq＆TCGA）的前20个差异基因
图6：m6A reader YTHDF1 调控 GPRIN1 表达
- GEPIA2 数据库中 YTHDF1 和 GPRIN1 之间存在强正相关。
（B，C）分别在 CPTAC 数据库中 YTHDF1 和 GPRIN1 的蛋白质表达。
(D) GPRIN1 的m6A peak分布。
(E) YTHDF1 的敲低下调了 LUAD A549 细胞中 GPRIN1 的 RNA 水平。
(F)通过 RT-qPCR 测量 A549 细胞中 RIP 衍生的 RNA。
结论：
本研究利用MeRIP-seq和mRNA-seq技术，证明了 m6A 修饰与 LUAD 进展之间强关联。筛选出了2个与LUAD患者的预后和诊断相关的基因（FCRL5和GPRIN1）。此外，还发现 GPRIN1 作为 YTHDF1 的下游目标。
关于易基因RNA m6A甲基化测序(MeRIP-seq)技术
易基因MeRIP-seq技术利用m6A特异性抗体富集发生m6A修饰的RNA片段（包括mRNA、lncRNA等rRNA去除所有RNA），结合高通量测序，可以对RNA上的m6A修饰进行定位与定量，总RNA起始量可降低至10μg，最低仅需1μg总RNA。广泛应用于组织发育、干细胞自我更新和分化、热休克或DNA损伤应答、癌症发生与发展、药物应答等研究领域；可应用于动物、植物、细胞及组织的m6A检测。
大样本量m6A-QTL性状关联分析，传统MeRIP单个样品价格高，通常难以承担。易基因开发建立MeRIP-seq2技术，显著提成IP平行性，实现不同样本间相对定量，降低检测成本。
易基因提供适用于不同科研需求的MeRIP技术：
- m6A甲基化-常量mRNA 甲基化测序（MeRIP-seq）
- m6A甲基化-常量mRNA +lncRNA甲基化测序（lnc-MeRIP-seq）
- m6A甲基化-微量mRNA +lncRNA甲基化测序（Micro-lnc-MeRIP-seq）
- 高通量m6A甲基化-常量mRNA甲基化测序（MeRIP-seq2）
技术优势：
- 起始量低：样本起始量可降低至10-20μg，最低仅需1μg总RNA；
- 转录组范围内：可以同时检测mRNA和lncRNA；
- 样本要求：可用于动物、植物、细胞及组织的m6A检测；
- 重复性高：IP富集重复性高，最大化降低抗体富集偏差；
- 应用范围广：广泛应用于组织发育、干细胞自我更新和分化、热休克或DNA损伤应答、癌症的发生与发展、药物应答等研究领域。
研究方向：
m6A甲基化目前主要运用在分子机制的理论性研究
- 疾病发生发展：肿瘤、代谢疾病（如肥胖/糖尿病）、神经和精神疾病（如阿尔兹海默症/抑郁症）、炎症…
- 发育和分化：早期胚胎发育、个体/组织/器官生长发育、干细胞分化与命运决定、衰老
- 环境暴露与响应：污染、抗逆、生活方式
关于m6A甲基化研究思路
（1）整体把握m6A甲基化图谱特征：m6A peak数量变化、m6A修饰基因数量变化、单个基因m6A peak数量分析、m6A peak在基因元件上的分布、m6A peak的motif分析、m6A peak修饰基因的功能分析
（2）筛选具体差异m6A peak和基因：差异m6A peak鉴定、非时序数据的分析策略、时序数据的分析策略、差异m6A修饰基因的功能分析、差异m6A修饰基因的PPI分析、候选基因的m6A修饰可视化展示
（3）m6A甲基化组学&转录组学关联分析：Meta genes整体关联、DMG-DEG对应关联、m6A修饰目标基因的筛选策略
（4）进一步验证或后期试验
易基因科技提供全面的RNA甲基化研究整体解决方案，技术详情了解请致电易基因。
参考文献：
Mao W, Yu Q, Wang K, Ma Q, Zheng Y, Zhang G, Luo W, Wang N, Wang Y. Comprehensive Analysis of the Transcriptome-wide m6A Methylome in Lung Adenocarcinoma by MeRIP Sequencing. Front Oncol. 2022;12:791332.
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