易基因|病毒抗性:全基因组DNA甲基化揭示草鱼年龄相关病毒易感性的表观遗传机制

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2022年06月02日,淡水生态与生物技术国家重点实验室(中国科学院水生生物研究所)何利波副研究员为第一作者和通讯作者,汪亚平研究员为共同通讯作者在《Immun Ageing》杂志发表了题为“Genome-wide DNA methylation reveals potential epigenetic mechanism of age-dependent viral susceptibility in grass carp”的研究论文,该研究通过全基因组DNA甲基化测序(WGBS)和对应的转录组测序(RNA-seq),并通过BSP和qPCR验证,揭示了草鱼年龄依赖病毒易感性的潜在表观遗传机制。

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标题:Genome-wide DNA methylation reveals potential epigenetic mechanism of age-dependent viral susceptibility in grass carp(全基因组DNA甲基化揭示了草鱼年龄相关病毒易感性的潜在表观遗传机制)

时间:2022.06.02

期刊:Immunity & Ageing

影响因子:IF 9.701

技术平台:WGBS、RNA-seq、BSP、qPCR

样本实验:

选取未进行病毒攻击实验的草鱼,性别比例1:1,取其脾脏组织样本进行WGBS和RNA-seq测序分析。分为FMO组和TYO组,每组三个重复,共六个文库(每个文库n=5)。

研究思路:

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背景意义:

草鱼(Ctenopharyngodon idellus)是中国重要的养殖鱼类,受到多种病原体,尤其是草鱼呼肠孤病毒(GCRV)的感染。值得注意的是,草鱼对 GCRV 的敏感性与年龄有关,也就是说,一年以下的草鱼对GCRV敏感,而三年以上的草鱼对这种病毒有抗性。然而,潜在的机制仍不清楚。

本研究以5月龄感病草鱼(five-month-old,FMO)和3年龄抗病草鱼(three-year-old,TYO)为研究对象,对其全基因组DNA甲基化和基因表达变化进行了研究,旨在揭示潜在的表观遗传机制。

结果:

比色法定量检测结果显示,TYO组整体甲基化水平高于FMO组。TYO组和FMO组的全基因组重亚硫酸盐测序(WGBS)分析,结果发现6214个差异甲基化区域(DMR)和4052个差异甲基化基因(DMG),其中大部分DMR和DMG在TYO组中表现出高甲基化模式。相关分析表明,启动子区域的DNA低甲基化和基因体(gene body)区域的DNA高甲基化与基因表达有关。富集分析表明,TYO组中的启动子区hypo-DMG在免疫反应通路中显著富集,而TYO组基因体区hyper-DMG在RNA转录、生物合成和能量产生方面显著富集。对应的RNA-seq分析表明,大部分基因在TYO组中上调。此外,基因功能分析显示,参与能量代谢的两个基因表现出抗病毒作用。

结论

本研究利用WGBS和RNA-seq技术,揭示了不同年龄草鱼 DNA 甲基化的全基因组变化。与免疫应答、生物合成和能量代谢相关的基因的 DNA 甲基化和基因表达的变化可能导致草鱼对GCRV的年龄依赖易感性。该研究结果为草鱼的抗病育种计划提供了重要信息,也可能有利于对人类年龄依赖性疾病的研究。

相关图形

(1)整体甲基化概况和全基因组重亚硫酸盐测序

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图1:两组对草鱼呼肠孤病毒(GCRV)的年龄依赖性易感性和整体甲基化概况

  1. 两组草鱼感染GCRV后的总死亡率。
  2. 两个草鱼群体整体DNA甲基化水平。
  3. CG、CHG和CHH中甲基胞嘧啶的百分比。
  4. mCG、mCHG和mCHH位点附近序列的Logo图。
  5. 两组间DNA甲基化水平分布。

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表1:WGBS数据

(2)基因甲基化图谱分析

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图2:平均甲基化胞嘧啶(mC)在不同基因组区域分布以及两组鉴定的差异甲基化区域(DMR)。

  1. 基因体区域及其上下游区域的相对甲基化水平。
  2. 不同基因元件的相对甲基化水平。
  3. DMR热图。
  4. DMRs在基因组中的分布。

(3)DNA甲基化与基因表达的相关性研究

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表2:RNA-seq数据

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图3:不同基因的DNA甲基化和mRNA表达。

  1. 5月龄感病组不同基因分组(具有不同的mRNA表达水平)的甲基化水平。
  2. 5月龄感病组启动子区域不同基因分组(具有不同的甲基化水平)的mRNA表达水平。
  3. 5月龄感病组基因体区域不同基因分组(具有不同的甲基化水平)的mRNA表达水平。
  4. 启动子区下调DMGs的DNA甲基化与基因表达的相关性。
  5. 基因体区域上调DMGs的DNA甲基化与基因表达的相关性。

(4)DMG的功能富集分析

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表3:启动子区hypo-DMG和基因体区hyper-DMG的GO富集分析(TOP 10)

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图4:不同DMG的富集分析和不同基因的mRNA表达谱

  1. 启动子区域hypo - DMGs的KEGG富集分析。
  2. 基因体区域hyper - DMGs的KEGG富集分析。
  3. 参与免疫反应的基因的散点图。
  4. 参与蛋白质合成的基因的散点图。
  5. 参与能量代谢的基因的散点图。

(5)BSP和 qPCR 对WGBS数据验证

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图5:通过BS-PCR和qPCR验证WGBS数据

  1. stat1b基因启动子区的DNA甲基化和基因表达谱。
  2. trap1基因启动子区的DNA甲基化和基因表达谱。
  3. gapdh基因的基因体区DNA甲基化和基因表达谱。
  4. ldha基因的基因体区DNA甲基化和基因表达谱。

(6)代谢相关基因的抗病毒作用

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图6:两个代谢相关基因的抗病毒作用。

  1. Western blotting证实了两个基因在转染细胞中的过表达。
  2. 不同质粒转染细胞中编码GCRV非结构蛋白NS80和结构蛋白VP5基因的表达量。
  3. RT-qPCR证实siRNA敲低gapdhs。
  4. 不同siRNA转染细胞中编码NS80和VP5基因的表达量。
  5. RT - qPCR验证了siRNA对ldha的敲减。
  6. 不同siRNA转染细胞中编码NS80和VP5基因的表达量。

关于易基因全基因组重亚硫酸盐测序(WGBS)技术

全基因组重亚硫酸盐甲基化测序(WGBS)可以在全基因组范围内精确的检测所有单个胞嘧啶碱基(C碱基)的甲基化水平,是DNA甲基化研究的金标准。WGBS能为基因组DNA甲基化时空特异性修饰的研究提供重要技术支持,能广泛应用在个体发育、衰老和疾病等生命过程的机制研究中,也是各物种甲基化图谱研究的首选方法。

易基因提供的全基因组甲基化测序技术通过T4-DNA连接酶,在超声波打断基因组DNA片段的两端连接接头序列,连接产物通过重亚硫酸盐处理将未甲基化修饰的胞嘧啶C转变为尿嘧啶U,进而通过接头序列介导的 PCR 技术将尿嘧啶U转变为胸腺嘧啶T。

应用方向:

WGBS广泛用于各种物种,要求全基因组扫描(不错过关键位点)

  • 全基因组甲基化图谱课题
  • 标志物筛选课题
  • 小规模研究课题

技术优势:

  • 应用范围广:适用于所有参考基因组已知物种的甲基化研究;
  • 全基因组覆盖:最大限度地获取完整的全基因组甲基化信息,精确绘制甲基化图谱;
  • 单碱基分辨率:可精确分析每一个C碱基的甲基化状态。

易基因科技提供全面的DNA甲基化研究整体解决方案,技术详情了解请致电易基因。

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参考文献:

He L, Liang X, Wang Q, Yang C, Li Y, Liao L, Zhu Z, Wang Y. Genome-wide DNA methylation reveals potential epigenetic mechanism of age-dependent viral susceptibility in grass carp. Immun Ageing. 2022 Jun 2;19(1):28.

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