limma | 配对样本的差异分析怎么搞！？（一）

1写在前面

最近在用limma包做配对样本的差异分析，在这里和大家分享一下吧。

大家可以先思考一下，配对和非配对的结果一样吗？？

应用场景： 同一病人的癌和癌旁样本，同一样品的多时间点测序等。

2用到的包

rm(list = ls())
library(tidyverse)
library(limma)
library(GEOquery)

3示例数据

这里我从GEO数据库上download了一个dataset。
在3个样本中对T细胞和B细胞分别进行了转录组分析。
每个样本的细胞都分为Control或anti-BTLA组。

我们先常规下载数据吧，boxplot不是很齐啊，强迫症的我必须标准化！

GSE194314 <- getGEO('GSE194314', destdir=".",getGPL = F)
exprSet <- exprs(GSE194314[[1]]) 
boxplot(log2(exprSet))

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exprSet <- normalizeBetweenArrays(exprSet) %>% 
  log2(.)
boxplot(exprSet)

nice!~ 齐了，接着做吧。

4获取分组数据

pdata <- pData(GSE194314[[1]])

5整理分组数据

这里我们提取出分组数据后转为factor。

individuals <- factor(unlist(lapply(pdata$characteristics_ch1.1,function(x) strsplit(as.character(x),":")[[1]][2])))

treatment <- unlist(lapply(pdata$characteristics_ch1.2,function(x) strsplit(as.character(x),":")[[1]][2]))

treatment <- factor(treatment,levels = unique(treatment))

6非配对处理

6.1 整理分组矩阵

这里我们只把treatment作为分组信息纳入design中，不进行配对。

design_non_paried <- model.matrix(~ 0 + treatment)
colnames(design_non_paried) <- c("Control","anti-BTLA")

fit1 <- lmFit(exprSet,design_non_paried)
fit1 <- eBayes(fit1)

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6.2 差异分析

allDiff_non_paired <- topTable(fit1,
                             adjust = 'BH',
                             coef =  "anti-BTLA",
                             n = Inf,
                             #p.value = 0.05
                             )

7配对处理

7.1 整理分组矩阵

design_paried <- model.matrix(~ individuals + treatment)
fit2 <- lmFit(exprSet,design_paried)
fit2 <- eBayes(fit2)

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7.2 差异分析

allDiff_paired <- topTable(fit2,
                             adjust = 'BH',
                             coef = "treatment anti-BTLA",
                             n = Inf)

8对比结果

我们直接用火山图可视化对比一下吧。 这里我们把阈值设置为|logFC|>1，pvalue<0.05。

library(EnhancedVolcano)
library(patchwork)

p1 <- EnhancedVolcano(allDiff_non_paired,
    lab = rownames(allDiff_non_paired),
    x = 'logFC',
    y =  'P.Value',
    title = 'non_paired',
    pointSize = 3.0,
    labSize = 6.0,
    legendPosition = 'right',
    pCutoff = 0.05,
    FCcutoff = 1)
  

p2 <- EnhancedVolcano(allDiff_paired,
    lab = rownames(allDiff_paired),
    x = 'logFC',
    y =  'P.Value',
    title = 'paired',
    pointSize = 3.0,
    labSize = 6.0,
    legendPosition = 'right',
    pCutoff = 0.05,
    FCcutoff = 1)

p1 + p2

这配对和非配对的区别还是挺大的！

9小彩蛋

细心的小伙伴肯定发现了，这里我们假设T细胞和B细胞是同一个细胞，不进行区分。
但实际上需要进行T细胞和B细胞分层对比，下期我们再介绍Multi-level如何处理吧。

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最后祝大家早日不卷!~

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点个在看吧各位~ ✐.ɴɪᴄᴇ ᴅᴀʏ 〰

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