易基因｜NSUN2介导RNA m5C修饰促进食管鳞状细胞癌进展的表观调控机制 | 肿瘤研究

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2021年8月3日，中山大学肿瘤防治中心华南肿瘤学国家重点实验室研究团队在《Oncogene》杂志发表了《NSUN2-mediated RNA 5-methylcytosine promotes esophageal squamous cell carcinoma progression via LIN28B-dependent GRB2 mRNA stabilization》的研究论文，该研究通过RNA-BS、RNA-seq等技术揭示NSUN2介导的RNA m5C甲基化修饰通过LIN28B依赖性GRB2 mRNA稳定促进食管鳞状细胞癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）的进展。

标题：NSUN2-mediated RNA 5-methylcytosine promotes esophageal squamous cell carcinoma progression via LIN28B-dependent GRB2 mRNA stabilization

时间：2021.08.03

期刊：Oncogene

影响因子：IF 8.756

技术平台：RNA-BS、mRNA-seq

样本：7个ESCC患者肿瘤组织（实验组）+ 7个肿瘤附近正常组织（对照组）

研究思路：

研究摘要：

5-甲基胞嘧啶（m5C）是一种参与许多关键生物过程的转录后RNA修饰，，但其在人类癌症中的作用尚不清楚。本研究通过检测食管鳞状细胞癌（ESCC）中转录组范围的m5C谱，发现由于m5C甲基转移酶NSUN2的过表达，ESCC肿瘤中的m5C甲基化水平增加。NSUN2异常表达受E2F转录因子1（E2F1）的正向调控， NSUN2高表达预示ESCC患者生存率低。此外NSUN2沉默抑制了NSUN2敲除小鼠模型中ESCC肿瘤的发生和进展。从机制上，由新型m5C介质蛋白lin-28同源物B（LIN28B）介导的NSUN2诱导生长因子受体结合蛋白2（GRB2）的m5C修饰并使其mRNA稳定，GRB2上调增加了PI3K/AKT和ERK/MAPK信号的激活。这些结果表明，NSUN2通过GRB2转录本的m5C-LIN28B依赖性稳定来促进ESCC的发生和进展，为ESCC提供了一种有前景的表观转录组靶向治疗策略。

背景意义：

食管鳞状细胞癌 (ESCC) 是恶性程度最高的癌症之一， 5年生存率仅为 19% 。由于缺乏有效的治疗方式，大多数 ESCC患者最终死于癌症的进展 。因此，迫切需要进一步阐明 ESCC的综合分子机制，以开发更有效的ESCC诊断和治疗干预措施。

最近的发现表明，表观遗传调控的异常（如RNA甲基化）是肿瘤发生、进展和复发的重要标志。5-甲基胞嘧啶 (m5C) 是最广为人知和最保守的 RNA 修饰之一。 NSUN2是催化哺乳动物 mRNA m5C修饰的主要甲基转移酶，新出现的证据表明，NSUN2介导的RNA m5C甲基化在细胞增殖、发育和分化中起着关键作用 。 NSUN2的突变或异常表达与多种疾病有关，如癌症和发育障碍。然而，关于NSUN2介导的mRNA m5C修饰在人类疾病，尤其是人类癌症中的精确调控机制知之甚少。

结果图形

（1）NSUN2异常上调在 ESCC 中起致癌作用

图1：ESCC患者NSUN2表达上调与不良临床结局相关。

(A-B) 肿瘤组织和正常组织中NSUN2(A)或NSUN6(B) mRNA的表达水平

(C) 不同时期肿瘤组织中NSUN2 mRNA的表达水平

(D) 不同NSUN2 mRNA 水平患者的Kaplan-Meier 分析

(E) 肿瘤组织和正常组织中的NSUN2蛋白水平

(F-G) 肿瘤组织和正常组织中 NSUN2 蛋白水平的代表性免疫组织化学染色 (IHC) 图像(F)与评分(G)

(H) 不同时期肿瘤组织中NSUN2 蛋白水平的代表性免疫组织化学染色 (IHC) 评分

（i）不同NSUN2蛋白水平患者的Kaplan-Meier 分析

（2）NSUN2表达受 E2F1 正调控

 

图2：转录因子E2F1正向调控ESCC中的NSUN2表达

（a） NSUN2启动子区域中潜在转录因子的分析

(B-C) 正常与敲低转录因子的ESCC 细胞中NSUN2 mRNA的表达水平(B)与蛋白质水平(C)

(D) NSUN2启动子中推定的 E2F1 结合位点的示意图和用于染色质免疫沉淀 (ChIP) 分析的引物

(E) 使用抗 E2F1 抗体或 IgG 对细胞进行 ChIP-qPCR

(F) 在指定质粒或 siRNA 共转染 48 小时的细胞中进行荧光素酶报告基因检测

(G) 肿瘤组织和正常组织中E2F1的表达水平

(H) NSUN2表达水平与E2F1的表达水平的Spearman相关性分析

（3）NSUN2 促进ESCC 的肿瘤发生和进展

图3：NSUN2促进ESCC细胞的恶性表型，增强NSUN2基因敲除小鼠的肿瘤发生和发育

(A-H) ESCC 细胞增殖(A-B、E-F)、迁移和侵袭(C-D、G-H)能力的测定

1. 4-NQO诱导的ESCC小鼠模型的时间线示意图

(J) Nsun2 +/+ 小鼠4-NQO 戒断 4 周或 8 周后正常食管或食管组织的病理学特征(上)或 NSUN2 水平(下)

(K-M) 在4-NQO 停药 12 周后，Nsun2 +/+ 小鼠（n = 10）及Nsun2 +/−（n = 10）小鼠的食管形态学图像 ( K )、肿瘤数量 ( L ) 或肿瘤大小 ( M )

(N) 在 4-NQO 停药 12 周后,Nsun2 +/+ 小鼠及Nsun2 +/- 小鼠食管的病理学特征(上)或 NSUN2 水平(下)

(O) Nsun2 +/+ 小鼠与Nsun2 +/- 小鼠的Kaplan-Meier 分析

（4）NSUN2介导的 m5C高甲基化激活ESCC中的PI3K/AKT 和 ERK/MAPK 信号

图4：NSUN2诱导ESCC中m5C高甲基化并激活PI3K/AKT和ERK/MAPK信号

(A-B) 肿瘤组织和正常组织（n = 7）之间 m5C 位点的差异甲基化水平的热图(A)分布图(B)

(C) 肿瘤组织vs正常组织中具有m5C高甲基化转录本的基因的典型通路分析

(D) 参与10个典型癌症相关通路的45个代表性基因的甲基化水平热图

(E) 参与这些癌症相关通路的基因示意图

(F-G) 肿瘤组织和正常组织中参与癌症通路的代表性高甲基化基因的m5C-RIP-qPCR或RNA-BisSeq结果

(H) 肿瘤中NSUN2 转录本水平与m5C 转录本水平的Spearman相关性分析

（i）过表达或敲低NSUN2的ESCC细胞中，(F)中提到的转录本的相对m5C水平

(J-K) Western blotting实验

（5）GRB2是 NSUN2诱导PI3K/AKT和ERK/MAPK信号的关键靶点

图5：NSUN2通过增强GRB2 mRNA稳定性来诱导致癌PI3K/AKT和ERK/MAPK信号

(A-B) Western blotting实验

(C-D) 过表达或敲除NSUN2 的ESCC 细胞中GRB2 mRNA 表达水平 (C)和蛋白质水平 (D)

(E-F) 野生型、突变体的GRB2 mRNA表达水平 ( E ) 和蛋白质 水平( F )

(G) GRB2、p-AKT、p-MEK 或 p-ERK 在Nsun2 +/+ 小鼠不同病理阶段的食管组织中的表达水平

(H) 在 4-NQO 停药 12 周后，Nsun2 +/+ 小鼠及其Nsun2 +/- 小鼠食管组织中GRB2、p-AKT、p-MEK 或 p-ERK的表达水平

(I-J) GRB2 mRNA表达水平与NSUN2 mRNA(I)或GRB2 m5C修饰水平(J)的Spearman相关性分析

(K-L) mRNA稳定性测试

(M) 荧光素酶报告基因测定

（6）LIN28B鉴定GRB2的m5C修饰并稳定GRB2 mRNA

图6：LIN28B通过鉴定m5C位点来稳定GRB2 mRNA

1. KYSE30 细胞中有或无m5C修饰的蛋白质与 50 bp GRB2探针结合的散点图
2. 对从 RNA pull-down 测定中获得的潜在GRB2 [m 5 C] 结合蛋白进行Western blotting实验
3. 使用未甲基化或甲基化的GRB2探针对纯化的 flag 标记的 LIN28B 进行 RNA 电泳迁移率变动 (REMSA) 分析
4. 用纯化的flag标记的LIN28B对GRB2[m5 C]探针进行REMSA分析
5. IGV图

(F-G) PAR-CLIP-qPCR检测

(H) NSUN2降低对LIN28B蛋白水平的影响

1. 野生型和突变型中LIN28B与GRB2结合情况

(J) 正常组织和肿瘤组织中LIN28B mRNA的表达水平

(K) GRB2 mRNA表达水平与LIN28B mRNA表达水平的Spearman相关性分析

(L-N) 敲低LIN28B对GRB2 mRNA 表达水平( L ) 和蛋白质水平(M)及GRB2 mRNA 半衰期(N)的影响

(O) 荧光素酶报告基因测定

（7）GRB2 是ESCC的致癌基因，NSUN2-GRB2 轴与 ESCC 具有临床相关性

图7：NSUN2-GRB2轴在ESCC中的临床意义

(A-B) 肿瘤组织和正常组织中GRB2 mRNA的表达水平

(C) 不同GRB2 mRNA水平患者的Kaplan-Meier 分析

(D) 不同GRB2 m5C水平患者的Kaplan-Meier 分析

(E) 肿瘤组织和正常组织中GRB2的蛋白水平

(F-G) 肿瘤组织和正常组织中 GRB2 蛋白水平的代表性免疫组织化学染色 (IHC) 图像(F)与评分(G)

(H) 不同GRB2蛋白水平患者的Kaplan-Meier 分析

1. ESCC标本中NSUN2和GRB2蛋白水平的相关性代表性图像

(J) ESCC标本中NSUN2水平与相应的GRB2表达的IHC染色的统计分析

(K) GRB2 IHC评分与NSUN2 IHC评分的Spearman相关性分析

(L) E2F1-NSUN2-m5 C/LIN28B-GRB2-PI3K/AKT和ERK/MAPK信号轴在ESCC肿瘤发生和进展中的调控机制模型

结论：

本研究利用RNA-BisSeq和 RNA-Seq技术，揭示了NSUN2-m5C-GRB2-PI3K/AKT 和 ERK/MAPK 信号在 ESCC的发生和进展中的恶性作用。这些发现说明了m5C介导的ESCC的表观遗传调控机制，同时强调了 ESCC表观转录组靶向治疗的机会。

关于易基因RNA m5C甲基化测序(RNA-BS)技术

m5C是RNA百余种修饰中研究较多的一种。m5C存在于tRNA上时，可以对翻译进行调节；存在于rRNA上时，可以对核糖体的生物合成进行质控；存在于mRNA上时，则可以影响mRNA的结构、稳定性及翻译过程。

易基因提供适用于不同科研需求的m5C甲基化测序技术：

• 常规mRNA m5C甲基化测序（RNA-BS）：
  mRNA分离后首先通过亚硫酸盐处理，非甲基化的C转变为U，m5C修饰的碱基保持不变，结合高通量测序，可以对RNA上的每一个C碱基修饰进行定位与定量。
• 常规mRNA +lncRNA m5C甲基化测序（全转录组RNA-BS）：

易基因科技建立的升级版m5C RNA甲基化测序服务，去除人rRNA后，剩余RNA经重亚硫酸盐处理后，结合高通量NGS策略，可在全转录组范围内单碱基分辨率地检测基因m5C甲基化修饰分布。

技术优势：

• 高深度：超高深度重亚硫酸盐处理，检测准确性极高；
• 高通量：结合高通量NGS，全转录组范围内检测；
• 单碱基：单碱基分辨率，快速检测和分析RNA中的m5C。
• 高准确：精确的检测mRNA等每一个C碱基的的修饰水平。

研究方向：

• 与m6A甲基化类似，m5C甲基化已被证明与肿瘤、神经系统紊乱、代谢性疾病、病毒感染以及个体发育等密切相关。
• 此外，RNA甲基化（m5C）与人类疾病密切相关，其功能涉及调控干细胞应激、细胞毒性应激、mRNA出核和植物细胞发育及基因表达等方面。

实验策略：

易基因RNA m5C甲基化建库测序示意图

易基因科技提供全面的RNA甲基化研究整体解决方案，技术详情了解请致电易基因0755-28317900。

参考文献：

Su J, et al. NSUN2-mediated RNA 5-methylcytosine promotes esophageal squamous cell carcinoma progression via LIN28B-dependent GRB2 mRNA stabilization. Oncogene. 2021 Sep;40(39):5814-5828.

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