利用 DIAMOND、MCScanX、TBtools 分析物种基因组间的共线性区段与基因复制事件
本文通过 4 个兰花的基因组注释，主要利用 MCScanX 软件分析 NB-ARC 基因家族在不同物种间的共线性区段以及基因复制事件。步骤参考文献 Genome- Wide Analysis of the Nucleotide Binding Site Leucine-Rich Repeat Genes of Four Orchids Revealed Extremely Low Numbers of Disease Resistance Genes，Front. Genet.，08 January 2020。
MCScanX 通过 序列间的比对结果 及 序列的注释文件 来分析基因组中存在的共线性区段和基因复制事件。将分析的结果通过 TBtools 进行可视化展示。
一、使用 DIAMOND 进行蛋白组比对
参考链接：
- https://github.com/bbuchfink/diamond/wiki
DIAMOND 是 2015 年在 Nature Methods 上发布的一款 蛋白序列 比对软件，可以大批量、极高速的完成序列比对，并且操作简单。 DIAMOND 比对速度是 BLAST 的 100x-10000x，并且具有相似的精确度。这里使用 DIAMOND 进行蛋白组间的序列比对。
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使用 makedb 建库
$ diamond makedb --in species1.fasta -d species1 $ diamond makedb --in Apostasia_shenzhenica.fasta -d Apostasia_shenzhenica -
使用 blastp 进行蛋白组间的序列比对
diamond blastp -k3 -d species1 -q species2.fasta -o sp2sp1.blast -k 指输出文件中仅包含每个查询序列（query）匹配到的 top N 个目标序列。 如 -k3 表示根据匹配得分 输出 每个查询序列匹配到的前 3 个目标序列。
以 Apostasia_shenzhenica 作为参考蛋白组（-d），将剩余 3 个物种的蛋白组序列作为查询序列（-q）进行比对，物种间蛋白组比对时间 约几秒钟 完成：
diamond blastp -k3 -d Apostasia_shenzhenica -q Apostasia_shenzhenica.fasta -o ApAp.blast（9.8s）
diamond blastp -k3 -d Apostasia_shenzhenica -q Dendrobium_catenatum.fasta -o DeAp.blast（9.7s）
diamond blastp -k3 -d Apostasia_shenzhenica -q Gastrodia_elata.fasta -o GaAp.blast（4.2s）
diamond blastp -k3 -d Apostasia_shenzhenica -q Phalaenopsis_equestris.fasta -o PhAp.blast（7.9s）
二、提取注释信息
MCScanX 输入文件中的注释文件要求格式为 4 列，分别为 chr、gene、start、end，顺序不能乱且分隔符为 \t。在通过基因组的 gff 文件提取注释信息时需要注意的是：
- gene、mRNA、protein 的 id 可能不同，不同物种 id 存放的位置也可能不同，如 Gastrodia_elata 中 mRNA_id 存放在 mRNA 的 “Accession=” 后，protein_id 存放在 CDS 的 “Protein_Accession=” 后，而其他物种 gff 文件中mRNA_id、protein_id 都是存放在 mRNA 和 CDS 的 “ID=” 后。
- 输出的注释文件名需要以 .gff 作为 后缀。
三、使用 MCScanX 分析共线性及基因复制事件
参考链接：
- 「生信」共线性分析——MCScanX
- 基因组共线性工具MCScanX使用说明
- https://github.com/wyp1125/MCScanX
$ MCScanX fileanme
MCScanX 会读取当前目录下 fileanme.gff、fileanme.blast 两个文件，分析数据中由 片段复制（segmentally duplicate）事件 导致的 共线性（collinearity） 和由 基因复制事件 导致的 串联重复（tandemly duplicate） 。在比对结果中，如果一对配对（alignment）序列在染色体上是相连的，MCScanX 认为两序列中一条序列是由另一条序列复制产生的，即存在 1 个基因复制事件；如果多对配对在染色体上成簇存在，MCScanX 认为多对序列中一组是由另一组复制产生的，即存在 1 个片段复制事件。
MCScanX 会产生 2 个输出文件和 1 个输出文件夹：
- fileanme.collinearity 中记录了片段复制事件
- fileanme.tandem 中记录了基因复制事件
- fileanme.html/ 中以染色体为单位，展示了该染色体上基因的共线性事件和串联重复事件。第一列为共线性区段数量；第二列为染色体上基因，其中标红基因表示发生了串联重复（tandemly duplicate），与文件 fileanme.tandem 中内容一致；第 >=3 列表示各共线性区块，与文件 fileanme.collinearity 中内容一致。
在对 Apostasia_shenzhenica 物种内进行共线性分析时，MCScanX 找到了 63 个共线性区段、478 个串联重复。同理在对 Gastrodia_elata、Dendrobium_catenatum、Phalaenopsis_equestris 进行物种内共线性分析时，MCScanX 分别找到了 3、12、12 个共线性区段和 415、10304、8781 个串联重复。MCScanX 发掘的共线性区段较少，可能原因是输入的基因组是 Scaffold 而非拼接好的染色体，大量 Scaffold 中仅包含1个基因，碎片化的 Scaffold 使区块分析变得困难。各物种 Scaffold 数量：Apostasia_shenzhenica = 610，Dendrobium_catenatum = 551，Phalaenopsis_equestris = 4363，Gastrodia_elata = 507。
通过脚本提取 MCScanX 结果中包含 NB-ARC 结构域的蛋白，结果如下：
| NB-ARC | Apostasia_shenzhenica | Gastrodia_elata | Dendrobium_catenatum | Phalaenopsis_equestris |
|---|---|---|---|---|
| collinearity | 0 | 0 | 0 | 0 |
| tandem | 2 | 0 | 38 | 10 |
4个物种内均无包含 NB-ARC 蛋白的基因组重复事件（segmentally duplicate），但是包含了一些串联重复事件，这与参考文献中结果一致。
$ MCScanX PhGaDe_Ap
这里以 Apostasia_shenzhenica 蛋白组作为参考，将 Gastrodia_elata、Dendrobium_catenatum、Phalaenopsis_equestris 蛋白组与Apostasia_shenzhenica 蛋白组的比对结果整合成一组文件（PhGaDe_Ap.blast、PhGaDe_Ap.gff）后进行共线性分析，寻找 4 个基因组间的共线性区段。因为共线性区段的存在是相互的，所以改变参考蛋白组（reference）对结果影响不大。MCScan 的运行总时间约为 3 分钟，挖掘出了 1572 个共线性区块。
- 注意：MCScanX 会根据 gff 文件中染色体号的前缀（前2个字符）将染色体划分为不同的物种，若 MCScanX 识别到输入数据中包含多个物种，则不会生成 tandem 文件。
- 注意：PhGaDe_Ap 与分别比对（PhAp、GaAp、DeAp）中挖掘到的共线性区块是一致的，但 PhGaDe_Ap 将4个物种间的共线性区块整合在了一起，如 PhGaDe_Ap.html 文件夹中，可以方便的观察在物种间均存在的共线性区块。
通过脚本提取 MCScanX 结果中包含 NB-ARC 蛋白的共线性区块。实验发现了 PKA60334.1 蛋白所在的共线性区块在 Gastrodia_elata、Dendrobium_catenatum、Phalaenopsis_equestris 中也存在，PKA54312.1 蛋白所在的共线性区块在 Dendrobium_catenatum、Phalaenopsis_equestris中也存在。
PS：使用 MCScanX 中的 duplicate_gene_classifier 分析与各种复制事件相关的基因数量
$ duplicate_gene_classifier filename
$ duplicate_gene_classifier ApAp
duplicate_gene_classifier 的输入与MCScanX一致，读取当前目录下 fileanme.gff、fileanme.blast 作为输入，输出结果如下：
| Type of dup | Code | Number |
|---|---|---|
| Singleton | 0 | 88907 |
| Dispersed | 1 | 13573 |
| Proximal | 2 | 463 |
| Tandem | 3 | 847 |
| WGD or segmental | 4 | 1055 |
其中 Singleton 表示单拷贝，Proximal 表示在相同染色体上相近但不想连的重复，Dispersed 表示除 Tandem、WGD、Proximal 以外的重复。
注意，duplicate_gene_classifier 输出的是复制事件相关的 基因数，而 MCScanX 输出的是 复制事件的数量。如 ApAp 中总共有 63 个共线性区段，其中包含 1055 个基因；有 478 个串联重复事件，其中包含 847 个基因。
四、使用 TBtools 绘制共线性区段
TBtools 下载地址：
- https://github.com/CJ-Chen/TBtools/releases
TBtools 功能详细介绍参见：
- Circos图？太简单，用TBtools画啊
- 重新认识TBtools，减少你的生信分析烦恼
- 科研要酷 可用TBtools
Linux 下载 Source code，解压后通过 Java 打开 TBtools。这里通过 TBtools -> Graphics -> Advanced Circos 绘制 PKA60334.1 蛋白所在的共线性区块。Advanced Circos 需要提供三个输入文件：
- 染色体长度（chrID\tLength）
- 染色体上的基因信息（gff+color：ChrID\tFeatureName\tStartPos\tEndpos\tR,G,B）
- 染色体之间的连接信息（ChrID\tStartPos\tEndpos\tChrID\tStartPos\tEndpos\tR,G,B）
通过脚本根据共线性文件（fileanme.collinearity）和注释文件（fileanme.gff），提取出 TBtools 所需的输入文件。将文件输入给 TBtools：
- PKA60334.1.chr_length 文件内容如下，记录了要绘制的染色体及长度。
- PKA60334.1.label 文件内容如下，记录了要标注出来的蛋白（与PKA60334.1 比对上的包含 NB-ARC 结构域的蛋白）及位置。
- PKA60334.1.link 文件内容如下，记录了各染色体间连线的起点、终点及颜色。这里将包含 NB-ARC 的蛋白的共线性区块中的所有配对基因进行连线，非 NB-ARC 蛋白间连线为灰色（192,192,192），NB-ARC 蛋白间连线为红色（255,0,0）。注意！这里连线的顺序与 TBtools 的绘图顺序相关！TBtools 从文件 尾行 开始绘图，所以行数越小，图层越高，不想被遮挡的连线需放在文件开始几行。
- PKA60334.1.gene 文件内容如下，记录了染色体上各基因的位点及标注颜色。这里将 NB-ARC 蛋白标注为红色，其他蛋白标注为灰色。注意！这里基因标注的顺序与 TBtools 的绘图顺序相关！TBtools 从文件 首行 开始绘图，所以行数越大，图层越高，不想被遮挡的连线需放在文件最后几行。
PKA60334.1 的 Advanced Circos 输出结果如下。由于在比对的时候只比较了 Gastrodia_elata、Dendrobium_catenatum、Phalaenopsis_equestris 与 Apostasia_shenzhenica 间的关系，所以这里 Gastrodia_elata、Dendrobium_catenatum、Phalaenopsis_equestris 间没有连线。
- 这里没有展示 Chr Bar 和 Interval Tick，且 LinkPos = 95。
- Advanced Circos 中与 Pos 有关的绘图参数都是指与圆心的距离。