T细胞受体库测序

T细胞受体是T细胞识别靶细胞表面特异性抗原的蛋白分子，由α链和β链（分别由TRA和TRB编码）或者γ链和δ 链（分别由TRG和TRD编码）构成的异二聚体，主要是以α链和β链构成的异二聚体为主。α链和β链由恒定区（C区）、可变区（V区）、跨膜区及胞质区等组成，V区是特异性识别抗原肽/组织相容性抗原复合物（MHC）的关键部位。α链和β链的V区均含有3个高变区，又称互补决定区（CDR），分别为CDR1,CDR2,CDR3，而β链还有CDR4，CDR3是负责识别processed antigen的主要CDR。

tcr1.png

tcr2.png

TCR多样性超级丰富，可达10^15 - 10^18种，所以机体才有可能识别任何抗原。那么TCR多样性的产生原因是什么呢？
TCR多样性主要是V（D）J重组导致，这是一个随机过程，而V,D,J基因本身又具有多样性，不同的T细胞克隆经基因重排、发生不同基因片段的连接，产生特定的(VDJ)基因和(VJ)基因，从而表达特异性TCR，这是TCR多样性产生的主要机制。
TCRα链通过VJ重组产生，而β链通过VDJ重组产生；同样地，TCRγ链的产生涉及VJ重组，而TCRδ链通过VDJ重组产生。

tcr3.png

正常个体在没有抗原刺激的情况下，TCR基因重排是随机的，T细胞呈多家族、多克隆性特点。接受不同抗原刺激后，TCR V区基因可对抗原产生特异性识别，并使带有这类基因的 T细胞得到优势扩增。
TCR测序方法：
一、以DNA为起始材料，采用多重PCR方法扩增TCRβ CDR3片段：

多重pcr.jpg

二、以RNA为起始材料，采用5’RACE方法扩增全长TCR序列：

719bd169783e0912a2162aba.jpg

分析软件：mixcr
这是一款非常好用的TCR测序分析软件，适用于多种实验方法，包括多重PCR，5’RACE以及RNAseq和WES数据，用法也非常简单。
对于多重PCR方法，该软件分析命令如下：

mixcr analyze amplicon --species hs \
        --starting-material dna \
        --5-end v-primers \
        --3-end j-primers \
        --adapters adapters-present \
        input_R1.fastq input_R2.fastq analysis

对于5’RACE方法，该软件分析命令如下：

mixcr analyze amplicon --species hs \
        --starting-material rna \
        --5-end v-primers \
        --3-end j-primers \
        --adapters adapters-present \
        input_R1.fastq input_R2.fastq analysis

TCR测序主要应用于：
(1)V、D、J基因片段使用频率，CDR3 长度，插入及缺失碱基比例、CDR3氨基酸使用模式，不同抗原受体序列丰度及文库的多样性、克隆性；
(2)检测并了解克隆性增生或抗原特异性的T细胞的特征；
(3)追踪不同时间点疾病相关T细胞克隆变化；
(4)通过TCR氨基酸序列研究不同个体间的共有免疫细胞克隆。

相关概念：
有效TCRβ序列：
CDR3核苷酸序列及CDR3氨基酸序列：
相同TCRβ链CDR3序列称为一种克隆型：每种克隆型的序列数及频率：
多样性：VJ组合、VDJ组合、CDR3核苷酸克隆型数量、CDR3氨基酸克隆型数量：

TCR多样性比较指标：香农熵，数值越接近 0 表明免疫多样性越差，而越接近 1 表明免疫多样性越好。
高克隆序列（Highly enpended clone， HEC），高克隆序列是指表达量超过了总的 CDR3 序列的 0.5％的 CDR3 序列。
CDR3 氨基酸长度正态拟合：正常机体中， CDR3 氨基酸的长度呈正态分布， 然而在患有疾病的患者中， 其中一些特定的 CDR3 氨基酸序列会出现大量的表达，使 CDR3 氨基酸长度出现明显的差异。
基因使用频率分布：

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