qPCR也叫Real-time Quantitativ PCR,即实时荧光定量核酸扩增检测系统,就是在PCR扩增过程中,通过荧光信号,对PCR进程进行实时监测,以此实现在对初始模板的定量分析。
根据Real-time qPCR 的化学发光原理可以分为2大类: 一类为非探针类,其中包括如SYBR@ Green I染料法等,通过染料来指示扩增产物的增加。一类为探针类,包括TaqMan探针和分子信标,利用与靶序列特异杂交的探针来指示扩增产物的增加。
1、SYBR GreenⅠ染料法:
SYBR Green I是一种DNA结合染料,能与双链DNA小沟结合,与双链DNA结合后,其荧光大大增强,利用这一性质可对扩增产物检测。在PCR反应体系中,加入过量SYBR荧光染料,SYBRGreen荧光染料掺入DNA双链后能够吸收497nm的激发光并发出520nm的荧光,游离的SYBRGreen染料几乎没有荧光信号。
2、TaqMan探针法
在PCR扩增时加入一对引物的同时扩增时加入一个特异性的寡核苷酸荧光探针,该探针两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时,报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收;PCR扩增时,DNA聚合酶的5′-3’外切酶活性将探针酶切降解,使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离,从而荧光监测系统可接收到荧光信号,即每扩增一条DNA链,就有一个荧光分子形成,实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。
1、绝对定量
绝对定量是用己知浓度的标准品绘制标准曲线来推算未知样品的量。
将标准品稀释至不同浓度,作为模板进行PCR反应。以标准品拷贝数的对数值为横坐标,以测得的CT值为纵坐标,绘制标准曲线,对未知样品进行定量时,根据未知样品的CT值,即可在标准曲线中得到样品的拷贝数。
标准品:一般选用标准质粒,标准质粒构建步骤包括扩增目的基因片段、连接克隆载体、转化、挑克隆、测序验证、抽质粒、质粒浓度测定。
标准品梯度稀释:
标准品的扩增曲线和标准曲线如下面两个图:
根据待测样本的Ct及标准曲线可以计算出样本中的拷贝数。一般标准曲线至少5个稀释梯度,每个梯度做3个平行检测。
2、相对定量
相对定量一般是采用参照内参基因,通过对比内参基因判断特定样本中目的基因基因表达量上调或下降的倍数。该方法要求内参基因和目的基因具有相同的扩增效率,并尽可能接近100%。
相对定量的计算:
步骤1:内参基因均一化样本差异:Ct目的基因–Ct内参基因=△Ct
步骤2:其他样本和对照样本比较:△Ct处理样本–△Ct对照样本=△△Ct
步骤3:使用公式计算:倍数变化=2-△△Ct
实验流程图:
下面以SYBR GreenⅠ染料法绝对定量为例说明实现的流程:
1、扩增曲线
扩增曲线应为平滑的S型曲线,能够达到平台期。扩增曲线反应了定量过程样本管中荧光变化,起始样本目的基因越多,Ct值越小。阳性样本Ct值在15-30较好,负对照无起峰或Ct值大于35。复孔之间应重复性较好。
扩增曲线线性图谱:横坐标:扩增循环数(Cycle number ) ;纵坐标:荧光强度(De1ta Rn)。
线性基线期:指PCR反应处于起始阶段。此阶段,扩增产物很少,所产生的荧光信号很低,反应了系统背景情况。
指数增长期:指PCR达到其最大的扩 增阶段,理想条件下,每一循环后,PCR产物呈指数倍增加定量时,
线性增长期:指PCR达 到稳定的线性扩增阶段,PCR产物呈几何倍数增加。
平台期:由于原料消耗殆尽,扩增减缓,荧光信号不再随循环数增加而增加。
2、标准曲线
Ct值与起始模板拷贝数的对数存在线性关系。绝对定量通过标准曲线计算未知样本中目的基因拷贝数。标准曲线一般要求扩增效率(E)110%-90%之间,线性关系R2>0.99。
横坐标为log拷贝数,纵坐标为Ct值。
3、溶解曲线
我们一般通过溶解曲线判断qPCR结果的特异性,理想的溶解曲线应该是单峰、尖锐,异常的溶解曲线可能会出现双峰、杂峰等。
4、定量结果
标准品拷贝数设置完成后,仪器会根据输入的标准品拷贝数,自动计算待测样本拷贝数,根据定量时DNA/cDNA稀释倍数计算出样本中单位体积DNA拷贝数,再根据所抽提DNA的体积,抽提DNA时使用样本的质量或体积,得到单位单位质量/体积的样本中目标基因的拷贝数。所以在抽提基因组DNA时记录所使用的样本的种类和体积至关重要。
1、基线(baseline):在PCR扩增反应的最初数个循环里,荧光信号变化不大,接近一条直线,即称为基线。
2、阈值线( Threshhold) :荧光扩增曲线上人为设定的一个值,它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上,但一般我们将荧光域值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。
3、Ct (Cycle Threshhold)值:每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数被称为Ct值( threshold value )的10倍。Ct值也叫Cq (Quantification Cycle)
4、Rn(Normalized reporter):是荧光报告基团的荧光发射强度与参比染料的荧光发射强度的比值。
5、△Rn:△Rn是Rn扣除基线后得到的标准化结果(△Rn=Rn-基线)。
6、熔解曲线Tm(Tm Of Melting Curve):SYBR Green染料发实验结束后需对qPCR产物加热,随着温度的升高,双链接扩增产物逐渐解链,导致荧光强度下降,到达某一温度时,会导致大量的产物解链,荧光急剧下降,将此温度称为Tm值。不同PCR产物Tm值不同,从而可对PCR的特异性进行鉴定。
7、内参基因:内参即是内部参照,它们在各组织和细胞中的表达相对恒定,在检测基因的表达水平变化时常用它来做参照物。其作用是校正上样量、上样过程中存在的实验误差,保证实验结果的准确性。一般要选择一个在处理因素作用的条件下不会发生表达改变的基因作内参。
8、标准品:用于构建标准曲线的已知浓度或拷贝数的样品。
9、拷贝数:指样本中目标基因的个数。
10、扩增曲线:根据荧光信号相对于循环数而制作的曲线。
11、扩增效率(E):理想情况下qPCR扩增效率为100%,由1个DNA分子转变成2个DNA分子,但理想和现实总会存在差距,我们在实际实验中很难控制qPCR扩增效率稳定在100%。扩增效率偏高或偏低都会影响实验数据的准确性,控制在90%-110%之间,是时下大家公认可接受的误差范围。其中Slope是标准曲线的斜率,我们可以通过公式Eff= 10^ (–1/Slope) –1来计算扩增效率,也就是我们结果中的E。
12、StdDev Ct:Ct值的标准差,能够反应qPCR复孔的重现性,值越小代表重现性越好。