分享一下去年看过的一篇关于人SSC的文章：直译就是“成人睾丸转录细胞图谱”，这篇文章主要是进行的单细胞转录组分析，虽然是18年发的一篇文章，但是也可以为我们的单细胞分析提供一点思路。
文章：The adulthuman testis transcriptional cell atlas
来源：Cell Research (2018) 28:1141–1157; https://doi.org/10.1038/s41422-018-0099-2
说句题外话，这篇文章的作者今年又在Cell Stem Cell上发表了一篇青春期人睾丸发育动态的细胞转录图谱的文章（https://www.cell.com/cell-stem-cell/fulltext/S1934-5909(19)30523-5），也是作者在讨论中提到的想要研究的方向，这篇文章没仔细看，就讲讲上一篇文章。
——引言
先大概说一下背景，人类精子发生涉及到成熟精原干细胞(SSCs)受睾丸生殖系微环境体细胞调节，在平衡其自我更新和分化后，通过一系列复杂发育过程分化为成熟精子。而当前对人类精原干细胞及其调控的了解相对于小鼠研究而言还是比较少的，想要完全理解，就需要整合分子，基因组，蛋白质组学和生理学方法。
对此，这篇文章的作者提出可以使用单细胞转录组测序的方法来研究解决一些关于精原干细胞、分化精原细胞和配子发生的基本问题。例如：
What are themain molecular features that enable SSCs to serve as the longterm adultgermline stem cells?
使精原干细胞能够作为长期成体生殖系干细胞的主要分子特征是什么？
How do SSCstransition from their initial, most naïve and quiescent states to spermatogoniathat will eventually commit to meiosis?
精原干细胞如何从最初的、最naïve的和静止的状态过渡到最终会产生减数分裂的精原细胞？
Are thesetransitions irreversible, or do spermatogonia possess bidirectional plasticitythat helps ensure a lifelong pool of SSCs?
这些转变是不可逆的，还是精原细胞具有双向可塑性，有助于确保终生的精原干细胞池？
Beyondspermatogonia, what are the subsequent sequential transcription and signalingprograms that accompany gametogenesis?
在形成精原细胞之后，伴随着配子发生的后续连续的转录和信号传递的程序是什么？
How are theseprocesses influenced by communication with niche cells—what are the specificsignaling and transcription pathways that regulate selfrenewal, proliferationrates, metabolism, and transitions between differentiation states?
与生殖系微环境体细胞的沟通如何影响这些过程，以及调节这一系列过程的特定信号和转录途径又是什么？
带着这些问题，我们来看到作者所做的一些工作和得到的一些结论。
——正文内容
首先这是这篇文章实验数据的来源，转录组测序和免疫染色的成人睾丸样本来自17岁、24岁和25岁的三个健康男性，顺序单分子RNA荧光原位杂交也就是mRNA seqFISH的样本来自23岁的健康男性，用于转录组测序的婴儿睾丸样本来自两个13个月大婴儿捐赠者。
作者对三个成人睾丸样本都做了两个单独的技术重复，所以一共是得到六个数据集。这六个数据集中总共捕获约7000个细胞，经过标准质控后，有6490个细胞用于下游分析。
通过这个表可以看到获得的细胞中每个细胞的平均reads数大约25W，每细胞中进行分析的基因大约是2500个。测序饱和率>83%，技术重复高度相似(r>0.96)。
然后作者通过Seurat 的TSNE分析将这些细胞划分为13个群
而且可以看到不同批次或者细胞来源对分群的影响非常小，在每一个分群中都存在不同批次和来源的细胞的分布。
然后根据已知的细胞类型markers的表达来鉴定各个分群细胞的类型，作者通过不同分群的markers表达情况将9-13群分别定义为巨噬细胞macrophage，内皮细胞endothelial，肌样细胞myoid，支持细胞Sertoli和间质细胞Leydig，这里只是个大致的markers表达情况，具体的特异markers后面会提到。而生殖细胞系特异性markers仅在1-8群中表达，例如，DAZL和MAGEA4这两个marker。此外，已知的SSC marker(例如UTF1，ID4和FGFR3)（1群），分化marker(例如KIT和DMRT1)（2群differentiating spermatogonia），减数分裂marker(例如，SYCP3，SPO11和MLH3)（3-4群primary spermatocytes），精子细胞结构蛋白marker(例如，SPAG6，ZPBP，CAMK4和CREM) (5-6群round spermatids)和核凝集或鱼精蛋白重装配因子marker(例如TNP1和PRM2)在1至8群中显示了连续的表达情况，这也就初步反映了配子发生在这些分群中的一个从1到8的时间顺序。
然后通过小提琴图可以更直观的看到markers在不同分群中的分布，同时可以看到一些人鼠表达方面的异同，先看一下生殖系微环境体细胞也就是9-13群的marker表达，首先是第9群睾丸巨噬细胞，睾丸巨噬细胞能够促进精原细胞的维持，并特异性表达CD14，CD163，C1QA这几个marker。之前的一篇文章(Yang, Q.-E., Kim, D.,Kaucher, A., Oatley, M. J. & Oatley, J. M. CXCL12–CXCR4 signaling isrequired for the maintenance of mouse spermatogonial stem cells.J. Cell.Sci. 126, 1009–1020 (2013))发现小鼠的支持细胞Sertoli通过分泌CXCR4的配体CXCL12来帮助维持CXCR4阳性的精原细胞群体。而这篇文章里面显示在人类间质细胞也就是第13群（Leydig）中观察到编码CXCL12的RNA，而CXCR4在巨噬细胞和精原细胞中都表达，这可能表明这个配受体体系促进了巨噬细胞和精原细胞在人类中的共定位。此外，CSF1的受体CSF1R在巨噬细胞中特异性表达，而在小鼠中其表达仅限于精原细胞。这也是人鼠marker表达不同的地方之一。
然后看到第10群的内皮细胞Endothelial和第11群的肌样细胞Myoid，内皮细胞主要是高表达VWF 和 PECAM1这两个marker，肌样细胞主要高表达MYH11和ACTA2这两个marker，在这里能看到在第10群细胞中维持成年组织动态平衡的Notch信号的受体NOTCH4和这三个下游信号因子(JAG1，HES1和MAML1)被特异性上调，而且在这里对小鼠胎儿肌样细胞和间质细胞发育很重要的Hedgehog信号途径的受体(PTCH1，PTCH2)和下游信号成分(GLI和IGFBP6)在成年人类肌样细胞(11群)和间质细胞Leydig (13群)中也是高度表达。表明这两种信号活动在人类睾丸中会持续到成年期。
再看到第12群支持细胞Sertoli，支持细胞主要是表达SOX9和AMH这两个marker，它还表达了一种在人类生精小管基底膜中发现的整合素的marker ITGA6，这里还注意到的是支持细胞还表达了WFDC2和PRND这两种marker，WFDC2编码一种可能促进精子成熟的附睾蛋白，PRND则编码一种糖基化磷脂酰肌醇锚定的糖蛋白，这种蛋白可能与生殖细胞的受体相互作用。
最后来看到第13群，特异表达DLK1和IGF1的睾丸间质细胞Leydig，间质细胞也表达了一些特定marker，包括编码IGF结合蛋白的markerIGFBP5、IGFBP3、抑制素和激活素（抑制素可增强促黄体生成素刺激未成熟间质细胞生成睾酮的作用，另外,抑制素可调节精原细胞数量,研究显示，抑制素可使仓鼠和成年小鼠精原细胞数量减少，也可使成年大鼠精子细胞数目减少，激活素对精原细胞增殖有很强的促进作用，且对支持细胞有丝分裂有促进作用）的亚基marker INHBA，以及细胞外基质蛋白的marker VIT。
然后看到一些通路的表达情况，在这里作者发现睾酮生物合成的关键基因STAR和HSD17B3在12群支持细胞Sertoli和13群间质细胞Leydig中都有表达，而他们的反应基因SHBG和SRD5A2在成熟精子中表达。
维甲酸(RA)诱导生殖细胞分化，维甲酸合成酶的marker ALDH1A1和ALDH1A3在13群间质细胞Leydig和11群肌样细胞myoid中特异性表达；而维甲酸靶基因STRA8仅在精原细胞向精母细胞转变期间观察到。
此外作者还发现WNT配体WNT2B主要在11群肌样细胞Myoid中表达，而WNT2B受体主要表达于初级精母细胞，这大概表明WNT2B在人类减数分裂中起作用。
然后PDGFB在第10群内皮细胞中表达，其受体PDGFRA和PDGFRB在13群间质细胞Leydig和11群肌样细胞Myoid中发现，表明内皮细胞可能通过与其他微环境体细胞的串扰机制间接影响生殖细胞的发育。综上所述，作者得到的数据强调了人类和小鼠在生殖系-微环境相互作用方面的相似性和显著差异，当然这些都还需要进一步的详细功能研究。
前面作者通过markers鉴定认为，生殖细胞的发育顺序是由1-8群这么一个波浪状的连续过程，来概括精子发生的时间顺序，作者通过伪时间分析得到的这个时序也印证了这一点。
同时按照伪时间分析得到的时序进行样本的基因聚类分析，这里可以看到作者将生殖细胞系的样本聚类成12个不同的基因队列，通过GO分析发现也是印证了之前预想的比如说分化、减数分裂、精子最终形成的这种精子发生的发育顺序。
然后作者又对这八个分群进行连续的差异分析，确定了一系列差异表达基因，通过GO分析发现正如作者所预期的，上下调的基因中比较显著的是诸如“细胞周期”、“减数分裂”和“精子发生”（‘cell cycle’, ‘meiosis’ and ‘spermatogenesis’）的这类基因。而且在这里能发现在从精母细胞到圆形精子细胞的转变过程中，差异表达的基因是最多的，说明在这个过程中转录组学的变化是最大的。
同时作者还查看了一些转座因子(TE)和长非编码RNA(LncRNAs)在生精过程中的表达情况(高等生物中的反转录转座子源(retrotransposon)分为病毒家族和非病毒家族两类，前者为LTR(long terminal repeats)，有称为长末端重复，后者为SINE（short interspersed nuclear elements）和LINE（long interspersed nuclear elements），称为长散布重复序列与短散布重复序列（又称非长末端重复序列的反转录转座子）。)，发现LTR12C/D/E和活性转座因子SVA_D和AluYa5在生精早期高表达。相比较而言，LTR10a和LTR40c在精原细胞晚期或减数分裂后的时期高表达，而Satellite和多个MLT家族转座因子在精细胞和精子阶段表达。
此外，作者还探索了精子发生过程中X染色体失活和减数分裂性染色体失活(（Meiotic sex chromosome inactivation，MSCI）：发生在雄性减数分裂过程中，影响大多数或所有XY基因表达并导致形成浓缩的XY小体，MSCI的紊乱导致毒性基因错误表达和中粗线期生殖细胞死亡。)。作者观察到XIST在精原细胞阶段表达(图S4C、D)，并且在精原阶段X失活中心附近的基因表达出现衰减(图.S4E、F)，表明XIST介导的沉默在这一过程中起作用。
接下来，作者挑出了第三和第四群，也就是之前定义的减数分裂时期的初级精母细胞，进行了重新聚类，分出了5个子群。
并通过伪时间分析和使用已知的marker，指定了前细线期，细线期，偶线期或早期粗线期，晚期粗线期和双线期细胞类型。其中次级精母细胞表达不足，判断与它们迅速发展为圆形精子细胞有关。
基因聚类分析鉴定出五个不同的分子标记包含4594个基因，表明转录变化在进入减数分裂和退出减数分裂的过程中比较明显，但减数分裂期间变化较为平缓。这里作者特别提到，一些RNA结合蛋白marker在偶线期或早期粗线期上调，一些HOX基因(例如HOXB4和HOXC6)在晚期粗线期特异性表达。
同时作者观察到DMRT和SOX家族成员的动态表达模式：DMRT1和SOX4仅在前细线期细胞中表达，这与它们在小鼠减数分裂过程中进入抑制状态的作用是一致的。虽然DMRTC2和DMRT3的功能在很大程度上尚不清楚，但Sox30基因敲除可导致小鼠生殖细胞发育停滞在圆形精子细胞阶段，并降低Sox5的表达。总体而言，这个数据与小鼠的发现是一致的，但也为在减数分裂期间具有人类特异性功能的候选基因提供了证据。
为了进一步描述精原的具体状态，作者重新聚类了早期生殖细胞的1-2两群。该分析产生了五个不同的分群：虽然其中四个群state1-4显示出与先前描述的分群或状态高度相似，但此后识别出了一个额外的分群，这个分群被称为State0。伪时间分析揭示了从State0到state4的波状进展，
并且通过聚类分析定义了与每个状态相关的基因表达特征。值得注意的是，作者观察到State1和State2之间转录程序的显著转变，主要是细胞周期或增殖基因的表达(例如，MKI67)，这表明这种转变代表了一个关键的发育节点(见Discussion)。
虽然State0和State1细胞共同表达许多关键的干细胞信号因子和转录因子（TF）(图5c，d)，
但作者的分析鉴定了State0中最高表达或特异性表达的490个基因(例如，PIWIL4，EGR4，TSPAN33，PHGDH，PPP1R36，ICA1L(图5e，f))。已知的早期SSC marker(ID4，FGFR3，TCF3和UTF1)在State0和1中表达，而已知的分化marker KIT 或增殖marker MKI67 在State 2或之后特异表达，表明State0和State1可能代表两种不同的静止SSC状态。
而且这里大多数State 0细胞显示出ST3GAL2的低表达，这个marker是一种催化SSEA4形成的酶(图S5g)，表明State0细胞不表达SSEA4这种精原细胞表面marker。
接下来，作者应用一种新的RNA速度算法（‘velocity’ R包）来推断发育轨迹。这个算法通过与其他细胞中的转录本进行比较，可以定义表示每个单独细胞的未来转录状态的速度矢量。在tSNE图(图6A)的每个细胞内，这个矢量的幅度和方向反映了转录轨迹。这一分析揭示了两个意想不到的特征。首先，在State0集群内，可以观察到两个亚群：一个靠近State1，携带较长的矢量箭头，表明向着State 1的明显进展，而另一个亚群都是携带比较短的矢量箭头。这种模式表明，下面这一个细胞亚群正在积极地向State1发展，以响应特定的发育信号，而上面这一个细胞亚群没有。
其次，还可以观察到State2细胞的亚群有一些显示指向State 1的长速度矢量。State0-1-2之间的这种向前和向后的运动，增加了人类精原细胞具有动态可塑性的可能性。
然后作者开始探索甲基化或染色质状态是否可以提供进一步的可塑性证据。首先，尽管刚才提到过的超过8000个基因在精原发育和精子发生过程中表现出差异表达(图3B)，但作者说他观察到SSEA4富集的人类SSCs和成熟人类精子的DNA甲基化谱几乎没有差异-这与在小鼠中的类似发现相似。因此，作者推断不存在可能阻止精原细胞去分化的DNA甲基化屏障。接下来，作者从分化的精原细胞中使用c-KIT富集分离出开放染色质，并将其与用SSEA4富集的自我更新的SSCs图谱进行比较(图6B)。可以看到，c-KIT和SSEA4富集的精原细胞的开放染色质图谱是高度相似的(r>0.83)，并且它们最近的peak峰通常是重叠的(距离约120bp)，这表明尽管存在数百个基因的激活和抑制，但在未分化的SSEA4阳性SSCs转变到分化的c-kit阳性精原细胞的过程中，开放染色质格局几乎没有发生变化。
综上所述，转录组分析、RNA速度趋势和来自开放染色质景观以及DNA甲基化分析的证据都指向这么一个假设，即SSCs遵循一个涉及5种顺序转录状态的发育过程，该过程的特点是染色质或DNA甲基化景观是一个比较稳定的状态，这强烈暗示了精原细胞的动态行为(图6C)。
为了评估这个State0是否代表成人中最naive的SSC，作者还分析了来自12-13个月大婴儿的睾丸细胞。经过质控过滤，获得了约1300个单细胞，并根据已知markers分配了细胞类型。这项分析确定了四种体细胞类型（巨噬细胞Macrophage，内皮细胞Endothelial，支持细胞Sertoli和间质细胞Leydig）(图7A，b；补充信息，图。S7)，以及一个由37个生殖细胞组成的分群类型。
通过tSNE和伪时间分析与成人SSC状态进行比较，将婴儿生殖细胞定位在与成人State0相邻的位置，处于发育轨迹的“起点”(图7C)。此外，大多数State0 markers在婴儿生殖细胞中高度表达(图7D)。一小部分因子(例如TBX3，HOXA3)在婴儿精原细胞中显示出特异性表达，这可能指定它们的种系身份。此外，婴儿体细胞的转录数据应该能为将来的分析提供有用的资源。
另外作者对5个关键基因进行了顺序单分子RNA荧光原位杂交(SeqFISH)(图8A；补充信息，表S6)。发现在中/高度表达TCF3的细胞，也就是STATE 0和STATE 1的细胞中，只有27%(9/33)的细胞同时高表达STATE 0的marker (PIWIL4)和STATE 1的marker (ETV5/L1TD1)，其余的细胞只表达两者之一。这在STATE 0和STATE 1的marke之间产生了显著的不重叠(超几何检验；p=0.03)，验证了之前的转录组分析结果。
然后作者试图使用细胞表面marker来富集State 0细胞，并评估它们的SSEA4状态。在这里，作者使用了TSPAN家族受体TSPAN33，它在State0中有很强的富集效应。流式细胞术对高水平表达SSC marker FGFR3的细胞(图5D)的分析表明，FGFR3高表达的细胞同时高表达TSPAN33但SSEA4的表达量比较低(图8B)，因此作者将State 0表述为具有FGFR3和TSPAN33共定位高表达但SSEA4表达量低的特征。
此外作者还想通过蛋白免疫荧光法原位观察SSC早期状态，作者通过三重免疫荧光(IF)染色鉴定了早期精原markers(UTF1、GFRA1、FGFR3和TCF3)的蛋白表达，这些markers在早期状态State 0-1-2中表现出差异表达。UTF1的表达量在State 0最高，并且与只在State 1的表达量最高的GFRA1部分重叠(图5D)。
作者观察到有大约66%位于生精小管外围的细胞表达UTF1或GFRA1，这和前面的分析是吻合的。在这里，能够区分出两种大概的精原细胞表型，分别是高表达UTF1 /低表达GFRA1和低表达UTF1/高表达GFRA1两种类型，它们大致概括了从State 0到State 1的时间进程。正如作者预期的那样，增殖marker MKI67与GFRA1或者UTF1几乎没有重叠(图8c和未显示的数据)，表明向增殖过程State 2的转变是发生在SSC的marker丢失的情况下的，这也和之前的分析(图5和6c)是一致的。
最后，作者进一步鉴定了State 0和State 1的特异性基因的表达。利用人类蛋白质图谱资源(http://www.proteinatlas.org/))回顾了490个State 0基因的模式，选择了16个在生精小管周边细胞中特异表达的候选早期SSC markers。UTF1和GFRA1三重免疫荧光(IF)染色显示，这16个markers均在GFRA1阳性或UTF1阳性细胞中表达。正如转录组分析预测的那样，PHGDH和PPP1R36的抗体在UTF1高表达细胞也就是State 0的细胞中荧光比较强(图8D)。
这里能观察到很多State 0的markers显示在State 1 marker标记的细胞中表达(图8D；补充信息，图S8b)，作者判断这可能是因为在State 0时期细胞中强烈表达的RNA(例如，UTF1)产生一种半衰期比其RNA更长的蛋白质，因此该蛋白质持续进入State 1时期。此外，作者观察到有一些marker与UTF1或GFRA1共同高表达的细胞在染色强度或亚核定位方面存在差异(图8D；补充信息，图S8b)。作者认为这是因为虽然在转录的定义上State 0和State 1是一个离散的状态，但它们可能代表的是相对稳定状态或者是异质的细胞表型，这种状态使得SSCs能够适应动态的生殖系体细胞微环境，并确保睾丸内的动态平衡调节。
——SUMMARY
总体而言，作者在这篇文章中通过对大约6500个成人的睾丸细胞进行分析及与其他数据的比较，起到了以下几个作用：
1、Reportednew data that reveal potential differences between mice and men, and changesduring development, for future functional investigation.
首先作者提供的数据揭示了小鼠和人之间的潜在差异，以及发育过程中的变化，这可以用于未来的功能研究。
2、Providedseveral new insights into spermatogonial development, most importantly theidentification of a novel and early quiescent state, termed State 0.
然后作者还提供了几个精原发育的新见解，最重要的是确定了一种新的早期的静止状态，称为State 0，并通过与婴儿生殖细胞进行比较，认为State 0细胞代表成人生殖系中一直由婴儿时期维持到成人时期的未分化和静止的“储备”干细胞库。
3、Providedtwo lines of evidence consistent with developmental plasticity in early humanspermatogonia.
此外作者也提出了两条人类早期精原细胞可塑性的证据，一是RNA速度分析挑出了一组State 2的精原细胞，它倾向于“去分化”成State 1状态的细胞。而且从State 1到State 2的转变过程中增殖marker上调，这可能正是动态调节的关键节点。二是作者观察到精原细胞发育轨迹上开放染色质和DNA甲基化的变化非常有限，这说明可能可以通过降低表观遗传障碍以实现转录水平的改变和去分化，从而实现转录的可塑性。