Seurat取子集时会用到的函数和方法

在单细胞数据分析中，在确定细胞类型后，除了可以进行差异表达基因分析外，还可以针对单个细胞类型进行分析特定分析，这时就需要我们提取细胞子集分开处理了。

一、Seurat数据格式

首先我们需要先对Seurat生成的数据格式有所了解：

单细胞数据格式思维导图

图片来源：周运来老师的：为什么要以数据库的思维来理解单细胞数据

解释：

Assays

默认情况下，Seurat对象是一个叫RNA的Assay。在我们处理数据的过程中，做整合（integration），或者做变换（SCTransform），或者做去除污染（SoupX），或者是融合velocity的数据等，都会生成新的相关的Assay，用于存放这些处理之后的矩阵。

在之后的处理中，我们可以根据情况使用指定Assay下的数据。不指定Assay使用数据的时候，Seurat调用的是Default Assay下的内容。我们可以通过对象名@active.assay查看当前Default Assay，通过DefaultAssay函数更改当前Default Assay。

Assay数据中，counts为raw原始数据，data为normalized（归一化），scale.data matrix为scaled（标准化的数据矩阵）。

调用方法： PBMC@assays$RNA@data ：调用normalized后数据

meta.data

元数据，对每个细胞的描述。一般计算的nFeature_RNA等信息就以metafeature的形式存在Seurat对象的metadata中。计算的分类信息一般以RNA_snn_res.x（x指使用的resolution）存放在metadata中。

                   orig.ident nCount_RNA nFeature_RNA percent.mito percent.HB RNA_snn_res.0.6 seurat_clusters
AAACCCAAGCGTATGG-1     pbmc      13509         3498    10.659560          0               1               1
AAACCCAGTCCTACAA-1     pbmc      12637         3382     5.610509          0               1               1
AAACGCTAGGGCATGT-1     pbmc       5743         1798    10.691276          0               7               7
AAACGCTGTAGGTACG-1     pbmc      13107         2888     7.866026          0               9               9
AAACGCTGTGTCCGGT-1     pbmc      15510         3807     7.446809          0               3               3
AAACGCTGTGTGATGG-1     pbmc       6131         2348     9.982058          0               5               5

调用方法：pbmc$orig.ident 或pbmc[["orig.ident"]]

active.assay和active.ident

前者是查看当前使用的assays，后者是查看当前的使用分群方式（可使用levels函数）

reduction

用于储存降维之后的每个细胞的坐标信息。
调用方法:

• 每个细胞在PC轴上的坐标
  head(pbmc@[email protected])

• 每个基因对每个PC轴的贡献度（loading值）
  head(pbmc@[email protected])

二、提取数据的函数

对Seurat对象结构有所了解之后，我们其实可以直接在Seurat对象中提取数据。可能为了方便，Seurat也提供了一些函数来帮助我们提取一些我们想要的数据。例如：

提取基因ID和细胞ID

• 获取全部基因ID：
  rownames(object)
• 获取整个object的细胞ID：
  Cells(object)，colnames(object)
• 按照idents获取部分细胞ID：
  WhichCells(object, idents = c(1, 2))
• 按照基因表达获取部分细胞ID：
  WhichCells(object, expression = gene1 > 1)
WhichCells(object, expression = gene1 > 1, slot = "counts")

提取降维之后的坐标信息

• Embeddings(object = object[["pca"]])
• Embeddings(object = object[["umap"]])

提取包含部分细胞的对象

• 按照细胞ID提取：
  subset(x = object, cells = cells)
• 按照idents提取：
  subset(x = object, idents = c(1, 2))
WhichCells(object, idents = 1)
subset(x=object, idents = "root") #对细胞簇重新命名后为root
• 想要排除1、2细胞类型，可以这样：
  subset(pbmc, idents = c(1, 2), invert = TRUE)
• 按照meta.data中设置过的stim信息提取：
  subset(x = object, stim == "Ctrl")
• 按照某一个resolution下的分群提取：
  subset(x = object, RNA_snn_res.2 == 2)
• 当然还可以根据某个基因的表达量来提取：
  subset(x = object, gene1 > 1)
subset(x = object, gene1 > 1，slot = "counts")

三、应用方法

查看每个聚类包含多少细胞？
table(Idents(pbmc))或table(pbmc$RNA_snn_res.0.3)

每个聚类细胞数占比
prop.table(table(Idents(pbmc)))或
prop.table(table(pbmc$RNA_snn_res.0.3))

提取表达矩阵
raw.data <- as.matrix(GetAssayData(pbmc, slot = "counts")或
raw.data <- as.matrix(pbmc@assays$RNA@counts)

提取某种细胞的表达矩阵
raw.data <- as.matrix(GetAssayData(pbmc, slot = "counts")[, WhichCells(pbmc, ident = "1")])

计算平均表达量
cluster.averages <- AverageExpression(pbmc)

获得所有的HVGsID
pbmc[["RNA"]]@var.features或pbmc@[email protected]
pbmc[["RNA"]]@var.features[1:10]：获得前十个

修改聚类后的因子水平
Idents(pbmc) <- factor(Idents(pbmc), levels= c(1,2,3,4,9,8,7,6,5,0))

参考：
Seurat Weekly NO.2 || 我该如何取子集？
Seurat v3.0命令列表
10xGenomics单细胞转录组亚群细分策略
Seurat V3 学习(二)
Seurat3.1的灵活操作指南