大家好！今天跟大家分享的文献是2021年4月发表在Cancer Cell International （IF=4.175）杂志上的一篇文章。作者基于TCGA数据集和MRGs构建了一个MRG的预后特征，可以用于预测LUAD患者预后。同时，作者对该预后特征进行额外数据集和实验验证。
题目：Establishment and validation of a prognostic signature for lung adenocarcinoma based on metabolism‐related genes
摘要
背景：代谢紊乱是癌症生物学的一个标志，本研究旨在构建和验证一个基于代谢相关基因（MRGs）的肺腺癌（LUAD）预后特征。
方法：从TCGA数据库下载LUAD样本的数据，从MsigDB数据库下载代谢相关基因。使用单因素Cox和多因素Cox回归分析构建预后特征并使用GSE31210数据集进行验证。此外，构建列线图预测LUAD患者1年，3年和5年的OS。使用校准图评估列线图的预测准确性。
结果：共鉴定到116个差异表达MRGs。单因素Cox回归分析鉴定到12个MRGs与OS显著相关。多因素Cox回归分析构建预后特征，该特征共包含6个基因。高风险组的免疫检查点表达水平较高，对免疫治疗更敏感。最后，作者在6个肺癌细胞系中鉴定到6个MRGs蛋白和mRNA的表达，并发现ENTPD2可能在LUAD细胞形成和迁移中发挥重要作用。
流程图
结果
1. 数据的获取和整理
从TCGA数据库下载LUAD患者的转录组和临床数据，共包含497例LUAD患者和54例正常样本。从GEO数据库下载GSE31210数据集，共包含174例LUAD患者。从MsigDB数据库下载代谢相关基因（MRGs）。
2. 鉴定差异表达MRGs
对TCGA-LUAD数据集进行差异分析，共鉴定到116个差异表达MRGs，其中有31个下调MRGs和85个上调MRGs（图1）。
图1 LUAD中差异表达MRGs
3. 差异表达MRGs功能富集分析
对116个差异表达MRGs进行GO和KEGG富集分析，共鉴定到431个GO terms和42个通路。前30个GO terms和KEGG通路如图2所示。
图2 差异表达MRGs的功能富集分析
4. 构建代谢相关预后特征
使用单因素Cox回归分析鉴定到12个MRG与OS显著相关（图3a）。在生存相关的MRGs中有10个基因是风险因子，其过表达可能会降低患者生存期。其余两个基因可能会提高患者生存期。随后构建LASSO分析（图3b和3c）。最后，采用多因素Cox回归分析构建预后特征模型，共包含6个MRGs（图3d）。
图3 构建代谢相关预后特征
风险打分= (0.001709×ALDOA) + (-0.01187×CAT) + (0.082279×ENTPD2) + (0.030344×GNPNAT1) +(0.003499×LDHA) + (0.018476×TYMS)。根据风险打分中位数将患者分为高风险组和低风险组。LUAD患者的风险打分，生存状态和基因表达热图如图4a-4c所示。Kaplan-Meier分析表明，高风险组的OS较低（图4d）。预测1年，3年和5年OS的ROC曲线的AUC分布为0.73，0.703和0.854，表明该预后特征性能较好（图4e）。
图4 TCGA队列预后风险特征
5. 预后特征的验证
使用GSE31210数据集对该预后特征进行验证。根据风险打分，将患者分为高风险组和低风险组。患者的风险打分，生存状态和基因表达热图如图5a-5c所示。Kaplan-Meier分析表明高风险组患者OS较差（图5d）。1年，3年和5年OS的ROC曲线的AUC值分别为0.654，0.705和0.725（图5e）。
图5 预后特征的验证
使用多因素Cox分析构建列线图（图6a），校准曲线表明列线图较好的预测性能（图6b-6d）。
图6 列线图
6. 关键MRGs的表达水平
研究预后特征中MRGs的表达水平，ALDOA,ENTPD2,GNPNAT1,LDHA和TYMS在LUAD组织中上调表达（图7）。
图7 MRGs的表达水平
随后，作者研究这些基因在高风险组和低风险组中的表达水平。结果表明，ALDOA、ENTPD2、GNPNAT1、LDHA、TYMS的表达水平在高风险组中较高而CAT的表达水平在低风险组中较高。蛋白水平的研究表明，ALDOA、ENTPD2、GNPNAT1、LDHA、TYMS在LUAD组织中的蛋白水平均高于正常组织（图8）。CAT的蛋白水平在LUAD组织中与正常组织中没有差异(图8b)。
图8 MRGs的蛋白表达水平
7. 预后特征的临床价值
使用单因素和多因素Cox回归分析，评估代谢相关预后特征与年龄，性别，组织学分期，病理分期和TNM分期等常见预后因素之间的独立预测能力。单因素Cox分析表明，病理分期，T分期，N分期和预后特征与OS显著相关（图9a），多因素Cox分析表明预后特征和病理分期可以作为独立的预后因素（图9b）。
图9 单因素和多因素Cox分析
为进一步评估MRGs的临床价值，作者研究了MRGs预后特征与临床特征的关系。结果表明，ALDOA,ENTPD2,GNPNAT1,LDHA和CAT在不同临床特征的患者中均差异表达（图10）。高风险打分与生存状态，N期和病理分期正相关（图10）。ROC曲线分析表明，风险打分预测0.5，1，2，3和5年OS的AUC分别为0.745，0.779，0.726，0.716，0.760和0.784，高于临床病理特征。
图10 MRGs表达水平与临床病理特征的相关性
8. 不同亚型LUAD患者的免疫/化疗反应评估
作者分析高风险组和低风险组患者免疫检查点分子（PD-L1，PD-L2，CTLA-4和PD-1）的表达水平。如图11a所示，高风险组的免疫检查点分子的表达水平较高。根据GDSC数据计算高风险组和低风险组的IC50值（图11b），结果表明高风险组中没有发现具有显著反应敏感性的化疗药物。以上结果表明，高风险组患者预后不良可能与免疫抑制微环境和化疗耐药有关。
图11 评估不同亚型LUAD患者的免疫/化疗反应
9. 实验验证
作者在肺癌细胞系和正常细胞系中检测ALDOA，ENTPD2，LDHA，TYMS和CAT的蛋白表达水平。肺癌细胞系中ALDOA，ENTPD2，LDHA，TYMS的蛋白表达水平明显升高，CAT的蛋白表达水平明显降低（图12）。
图12 MRGs蛋白表达水平
在肺癌细胞系和正常细胞系中检测ENTPD2，LDHA和CAT的mRNA表达水平。肺癌细胞系中ENTPD2（图13a）和LDHA（图13b）的表达水平显著升高，CAT（图13c）的表达水平显著降低。
图13 MRGs mRNA表达水平
ENTPD2可能是癌症患者的预后标志物和治疗靶点。作者对肺癌细胞系加入ENTPD2抑制剂POM-1，发现可以抑制A549和PC9细胞系的形成（图14b）。使用western blot检测肺癌细胞系中ENTPD2蛋白的表达水平（图14a）。此外，作者发现POM-1可以抑制肺癌细胞系的迁移（图14c）。
图14 ENTPD2功能验证
结论
本研究作者基于MRGs构建了一个预后模型，可以用于分析LUAD患者预后，并使用GEO数据集和实验进行验证。同时，作者首次在5种肺癌细胞系中发现ENTPD2对肺癌细胞的形成和迁移的作用。该预后特征可以为LUAD患者的诊断提供有价值的信息。但本文仍然存在一定限制，例如本研究纳入的数据集均来源于公共数据，不排除存在一定局限性和偏好性。
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