分子（DNA、RNA）样品的保存

本文将介绍DNA、RNA的保存策略，顺带提及细胞的保存方法。

一、DNA的保存

DNA为双螺旋结构，具有较高稳定性，但在野外样品采集的过程中仍需注意，以防降解。下面介绍以测序为目的的植物DNA采集与保存方法。

（一）组织的采集

通常采集用于测序的材料为当年生新鲜、幼嫩（近成熟）的健康组织，多以叶片为主，但当叶片难以获得时亦可采集植物的其它组织或器官（如芽、花、果实和种子等）。每份样品采集3-5g（鲜重），若为叶片可以表面积不小于50cm²计算（尺寸大小约等于成年人的手掌面积），每号DNA材料最好分为2份保存。可以将新鲜的植物DNA材料快速放入液氮（或带有冷藏功能的采集箱）中直至运输回实验室^[1]，回实验室后存于液氮或改用-80℃超低温保存，无需干燥，可长期保存（2年需行检查）。

用液氮或采集箱保存的缺点是不利于野外作业，下面着重介绍干燥保存的方法^[2]。将新鲜的植物DNA材料置于柔软且透气性较好的纸袋中进行干燥。透气的纸袋可以将植物DNA材料在干燥时与硅胶（干燥剂）分开，这样即便植物叶片因干燥变脆后，也不会在运输过程中被硅胶挤碎，不会与硅胶混杂，并造成样品间的交叉污染。如果没有类似的纸袋也可用塑料的自封袋替代，但植物DNA材料就需要与硅胶置于一起进行干燥。

对于易失水的植物DNA材料（如纸质叶或幼嫩叶片等），应在野外采集DNA材料并立即进行快速干燥；对于不易失水的植物遗传物质材料（如革质叶或蜡质叶等），可在采集后放置一段时间（在叶片失水前），然后再进行干燥，但最好在采集后立刻干燥；对于难于用硅胶快速干燥的遗传物质材料（如较厚或具多浆的叶片或种子等），可将这些材料碎成小片（块）后用硅胶快速干燥。

目前快速干燥植物DNA材料的最佳方式是硅胶（一种干燥剂），能够使植物材料在短时间内快速脱水，并且对DNA的损伤较小。有粉末状的白色硅胶（直径为20～30 Å）与变色硅胶（蓝色）两种类型可供选用，但混合使用效果更佳。粉末状硅胶能与组织紧密接触，加快干燥效率，变色硅胶则能显示出干燥的情况。通常变色硅胶是必要的，而粉末状硅胶可酌情使用。使用时应放入足够的硅胶（使硅胶覆盖全部的遗传物质材料）进行快速干燥。

（二）组织的保存

利用硅胶对植物组织干燥处理之中或之后，除野外采集过程，均需置于合适的环境当中。该环境的条件为温度（4-15℃）、湿度（相对湿度小于10%-30%），如果没有相应的保存条件，可在室温下保存，但一定保持在通风条件良好且干燥的环境下；植物DNA材料也可以在低温（-20℃）或超低温（-80℃）条件下保存，但需要保持DNA材料的干燥状态。尽管在这些条件下看似保险，但实际上植物DNA材料（如叶片等）很难长期保存，如在室温下保存超过2年的植物DNA材料其基因组DNA就会发生降解。因此另一种策略是保存总DNA。

（三）总DNA的保存

利用常规的方法（CTAB法、SDS法、试剂盒法等）提取材料总DNA，保存前需检查DNA的完整性、纯度、浓度和含量等。

植物总DNA的保存最好以干粉状态保存，如果总DNA以溶液形式保存，则用1 × TE缓冲液稀释，且TE的缓冲液的pH值为8.0-8.5之间。植物总DNA低温保存最好在-80℃以下或液氮保存，无条件的也可在-20℃保存；总DNA应避免经常冻融;同时建议每份样品保存3-5个样本。总DNA提取后保存的时限通常较组织要长（＞两年），但若长期保存，每隔两年应抽测，对不符合使用要求的DNA进行更新。

二、RNA的保存

RNA为单链分子，稳定性差，极易降解，降解的主要原因是内源性核酸酶（ribonuclease，RNAase）的作用，它在活体内的存在时间也不长。然而外源性RNA酶也不容忽略，头发、灰尘、体液、塑料等均有RNA酶的存在。因此RNA的保存需极其谨慎，提取时应该戴帽子、口罩、橡胶无菌手套，并在洁净、灰尘少的地方提取。从组织材料的采集开始，经运输与储存，包括实验的全过程，涉及到RNA的均需将其处于液氮中^[3]，该温度下细胞生理生化过程近乎停止，方能较长时间保存。这意味着不仅组织材料需保存于液氮中，实验操作也需保证液氮充足供应。将样品保存于-80℃等均无法制止RNA的局部或完全降解。

三、细胞的保存

细胞是DNA、RNA的载体，细胞也构成了组织。当涉及专属的细胞学实验时，便需要特殊的方法对其保存，这往往是细胞工程的基础。例如做单细胞克隆，要求细胞具有活力。又如基于某些目的使用流式细胞术分析细胞，此时要确保细胞能够相互分离，通常要求细胞具有活性，糖在细胞内的累积会导致分析不准。液氮的低温环境（-196℃）是目前最佳的冷冻保存温度，复苏后细胞的结构和功能完好。如果冷冻过程得当，一般生物样品在-196℃下可保存十年以上。应用-80℃保存细胞，短期内对细胞的活性无明显影响，但随着冻存时间延长，细胞存活率明显降低。

不同层次的样品，需根据样品性质、实验目的、保存条件，综合分析，选择最适合的方法。目的样品是分子水平，就需从分子角度考虑组织的保存；细胞水平，则是从细胞角度考虑。不同层次对细胞的活性要求也不同。

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参考文献

[1] 王珍,方宣钧.植物DNA分离[J].分子植物育种,2003(02):281-288.
[2] 高连明,刘杰,蔡杰,等.关于植物DNA条形码研究技术规范[J].植物分类与资源学报,2012,34(06):592-606.
[3] 张荻.百子莲花芽分化及开花机理研究[D].东北林业大学, 2011.

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[1] RNA降解原理. Cas9X海星生物 - 搜狐.
[2] 【科学普及】“最好细胞”的保存——浅谈细胞冻存. 政务：细胞世界 - 澎湃.