流式细胞术，你这磨人的小妖精

流式细胞术（Flow Cytometry ，FCM）是一种对液流中排成单列的细胞或其它生物微粒逐个进行快速定量分析和分选的技术。

一、小妖精的成仙之路

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二、样本类型

流式细胞仪可检测多种样本：外周血、骨髓、细胞穿刺液、洗脱液、实体组织、培养细胞、微生物。

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三、工作原理

流式细胞仪主要由3部分组成：液流系统、光学系统、电子系统。进行荧光染色后的待测细胞会在一定气体压力下被压入流动室，在鞘液的包裹下待测细胞呈单行排列，依次通过检测区域，被荧光染色的细胞在激光束的照射下会产生散射光和激发荧光。这两种信号会同时被光电倍增管( PMT) 接收。接收后可转换为电信号，再通过模/数转换器，将连续的电信号转换为可被计算机识别的数字信号。

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四、流式细胞术的应用

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五、操作过程中的注意点

1、上机前处理

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小心荧光淬灭

操作时必须严格按照孵育时间，如果抗体孵育时间过长，荧光是会逐渐淬灭的。那如果不得不推迟实验怎么办？可以把试管放在冰里面，这样会稍稍延长淬灭的时间。

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注意染色顺序

在进行多荧光染色的时候，相同的细胞会因为染色顺序不同而导致荧光强度的差异。解决办法为：预实验。做一系列的不同染色顺序的样本，通过对染色前和染色后的各种样本进行比较分析，判断染色顺序对细胞造成的影响。

选好染色方案

染色方案不合理也可能会导致荧光染色信号太弱。解决的方案：预实验。在正式开始实验之前，通过预实验，设计出一个完美的染色方案。（考虑试剂种类，试剂质量，试剂用量，孵育时间，洗涤次数，染料浓度，染色时间及染色温度等其他因素。）

做好阴性对照及同型对照试验

细胞阴性对照可以显示细胞基准的荧光水平。

同型对照则是为了查看抗体非特异性结合的水平。选择同型对照需要注意采用相同物种、相同亚类、相同染料、相同浓度，否则，检测的时候会出现乱七八糟的同型对照结果。

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选择合适的抗体

通用原则是：为表达最弱的抗原选择染色指数最高的荧光素。根据使用的流式细胞仪性能、激光器、滤光片种类来选择。对于多色实验，需选择发射光谱重叠小的染料。

2、参数设定

数据的获取必须是在仪器性能的校准均合格的基础上进行。仪器散射光和荧光信号的光电倍增管电压、增益、颜色补偿等参数的设定会直接影响结果。

电压

电压的调节需根据阴性对照管来调节。

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阈值

可以以任意参数及多个参数的组合作为阈值；大多数样本都可以设定FSC/SSC；阈值以下的信号不存储；可以根据阴性对照管来调节。

目的是将不需要的杂质信号，噪音信号，无用的细胞信号等扣除，使收集到的都是有用信号。

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补偿

流式细胞分析中经常要用到2种以上的荧光标记抗体进行染色，而目前所使用的多种荧光染料发射谱间有一定重叠。荧光补偿则可以从探测器种除去匹配荧光以外的任何荧光信号。

补偿方式：任意两个通道之间都可以调节。

补偿的调节：根据单染对照管来调节。

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六、数据分析

流式细胞仪分析细胞的各种参数都是通过光信号来实现的。光信号包括了散射光信号和荧光信号。散射光信号包括前向角散射（FSC，反应细胞的大小）和侧向角散射（SSC，反应细胞颗粒度）。荧光信号可以用来反应细胞的抗原表达等化学特性。

流式图的种类非常多，最常用的是流式直方图和流式散点图。

直方图

流式直方图只能显示一个通道的信息。

横坐标代表荧光信号或散射光信号相对强度，单位是对数，可以是线性或对数坐标。纵坐标一般是细胞数。

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散点图

X坐标为该细胞一参数相对含量，Y坐标为该细胞另一参数的含量，可以将细胞亚群分开。

FSC和SSC是流式中两个非常基本的参数，FSC的值能代表细胞的大小，细胞的体积越大，其FSC就越大。SSC则代表细胞的颗粒度，细胞内细胞器和颗粒度越大，则SSC越大。分析外周血细胞时，就可以利用FSC和SSC的特性把细胞分为淋巴细胞、单核细胞和粒细胞（左图）。

右图中可以看到X轴为CD3，Y轴为CD4，四个象限表示：左上是CD3-CD4+，左下是CD3-CD4-，右上是CD3+CD4+，右下是CD3+CD4-。

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等高线和密度图

等高图：类似于地图中的等高线，同一条线上的细胞数目相等，越在里面的曲线代表细胞数目越多。

密度图：点密度越大的地方细胞越多，点密度越小的地方细胞越少。

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三维图

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作者：向日葵

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