基于多组学网络的生物信息学方法识别 KTR中miRNA 生物标志物（IF8+）

Multi-omics network characterizationreveals novel microRNA biomarkers and mechanisms for diagnosis and subtyping ofkidney transplant rejection

多组学网络特征揭示了新的microRNA生物标志物和肾移植排斥反应的诊断和亚型划分机制

发表期刊：J Transl Med

发表日期：2021 Aug 13

DOI:  10.1186/s12967-021-03025-8

期刊相关信息

一、背景

        肾脏移植是临床治疗终末期肾衰竭患者的最有效方法。基于移植肾的稳定工作，电解质和酸碱平衡可以得到维持，患者不再需要透析的支持来消除代谢废物。然而，由于人体的免疫反应，肾移植排斥反应（KTR），包括抗体介导的排斥反应（AMR）和T细胞介导的排斥反应（CMR），被观察到有不可逆的影响，甚至导致肾脏异体移植功能丧失。

        微核糖核酸（miRNAs）是小型单链非编码RNA，有可能成为各种病症的生物标志物。最近的研究发现，miRNAs是肾脏移植相关的免疫过程中的功能调节器和指标。人们普遍认为，miRNA和mRNA之间的相互作用形成了大规模的miRNA-mRNA调控网络，这种网络系统的动态变化为疾病预测提供了功能上的启示。在生物医学大数据和人工智能时代，计算机辅助生物标志物发现已成为建模和破译复杂miRNA-mRNA调控的新领域。

二、材料与方法

1.数据来源

miRNA和mRNA数据集从GEO收集和下载：GSE30282共包含65个移植后活检样本；用Illumina HiSeq 2500筛选的6个AMR、4个CMR和6个稳定移植物功能样本的GSE115816作为独立的验证数据集

2.实验流程

图1    流程图

三、实验结果

01 - KTR特异性miR-PPIN的全球特征

        在这项研究中，通过整合DE-miRNA/mRNA、miRNA-mRNA和PPI数据，构建了一个KTR特异性miR-PPIN网络，用于系统地描述KTR中miRNA介导的相互作用。如图2a所示，该网络包含了31个miRNA和642个在KTR中异常表达的基因中总共949个miRNA-mRNA对和1447个PPI。根据图2b所述的STRING分析，网络中的基因在T细胞相关的BP术语中明显富集，如NK T细胞增殖、T细胞抗原处理和表达、记忆性T细胞激活的正向调节等，这表明所识别的网络在KTR发展中的特异性。

        为了描述网络中miRNAs和基因的全局特征，作者分别在miRNA-mRNA和PPI水平上分析了程度分布。如图2c和d所示，miRNA-mRNA网络中靶点较多的miRNA较少，大部分靶点倾向于位于PPIN的边界位点，因为节点的程度遵循幂律分布，斜率为-1.34。基于这些发现，然后根据目标基因在PPIN中的程度、接近性和间性特性，对目标基因的结构重要性进行了优先排序，并将高度优先的目标基因归为核心基因集，以加强miRNA的调控。最后，这两个网络系统的特征被协同测量，并在miR-PPIN中计算miRNA的CORE靶点的数量。如图2e所示，有极少数的miRNAs调节更多的CORE基因，它可能是发现生物标志物的一个潜在线索。

图2    KTR-specifcmiR-PPIN的结构特征和优先排序

02 - 用于KTR诊断和亚型划分的生物标志物miRNAs

        在本研究中，根据新定义的拓扑参数和筛选标准，即明显高的NTGA和NTGC，在多组学网络特征的基础上，共确定了三个miRNAs，即miR-145-5p、miR-155-5p和miR-23b-3p，作为KTR预测的候选生物标志物。如图3所示，miR-145-5p和miR-23b-3p在KTR组下调，而miR-155-5p在KTR特别是在CMR中过量表达。

图3    nKTR（正常对照）、AMR和CMR组中识别的miRNA生物标志物的表达模式

        对训练数据集和独立验证数据集进行ROC分析，以评估所确定的miRNAs和miRNA组合在KTR诊断和亚型划分中的潜力。在单个miRNA水平上，如图4a、b和e所示，所有三个miRNA在区分KTR和非KTR（nKTR，正常对照）的肾脏移植活检样本方面表现出很强的能力（AUC>0.8，平均AUC=0.898），而且它们在KTR亚型划分，即AMR和CMR（AUC>0.75，平均AUC=0.829）方面具有相当的能力。在验证组中，使用血液样本测量miRNAs，因为与肾脏组织相比，血液可以无创地获得。如图4c、d和e所示，miR-155-5p和miR-23b-3p在KTR预测上的表现趋于优异（AUC>0.75），而miR-145-5p在AMR和CMR亚型的AUC达到了0.917。与单个生物标志物相比，三个miRNA的组合提高了不同组别的总体表现，这表明三个miRNA作为组合特征在KTR管理中的潜力。

图4    确定的miRNA生物标志物及其组合特征在KTR诊断和亚型中的ROC分析

        应该注意的是，已鉴定的miRNA的AUC值在组织和血型之间是高度异质的。除了样本源的差异之外，数据集的数量和大小是另一个重要的考虑因素。因此，应进行基于大样本的一致性分析，以进行进一步的功能验证。

03 - 基于文献的功能验证和比较

        基于文献的调查是为了验证生物信息学模型的性能，并研究已确定的miRNA的功能。其中，miR-155-5p是与肾脏移植中异体器官功能障碍状态相关的一个被充分研究的对象。例如，Anglicheau等人（MicroRNA expression profiles predictive of human renal allograft status - PMC (nih.gov)）证明了miRNAs的移植内表达与mRNAs密切相关，这种调控的紊乱导致了急性排斥反应，影响了肾脏异体移植的功能。与此结果类似，Soltaninejad等人（Increased expression of miR-155 correlates with abnormal allograft status in solid organ transplant patients and rat kidney transplantation model - PubMed (nih.gov)）的研究中也检测到miR-155-5p在T细胞介导的排斥反应中的过表达，并建议该miRNA的诊断作用用于CMR预测。其余两个miRNA，即miR-145-5p和miR-23b-3p，也被报道在KTR进展中具有功能性。

        miR-155-5p是报道的KTR诊断的生物标志物，其余的候选物也与KTR特别是与肾脏急性排斥过程有密切联系，支持所提出的模型的整体预测性能。与以前的方法和研究结果相比，在KTR组中确定的miRNAs的表达模式是高度一致的。更重要的是，在这项研究中，基于网络的计算策略被应用于识别在KTR诊断（KTR vs. nKTR）和亚型（AMR vs. CMR）中具有生物标志物潜力的miRNAs，这为miRNA治疗KTR的发病机制提供了新的见解。

04 - KTR发病机制中的关键调节模块和机制

        免疫反应是肾移植后影响同种异体移植物功能的主要因素。在本研究中，免疫相关的BP词，如干扰素-γ介导的信号通路、I型干扰素信号通路、免疫反应、抗原处理和表达等，在KTR特异性miR-PPIN中被生物标志物miRNA靶点显著富集，包括HLA-A、HLA-C、HLA-G、SAMHD1、ICAM1、IRF1/2等。为了探索与确定的BP术语相关的遗传相互作用，Cytoscape的插件MCODE被应用于聚类功能模块以了解病理。根据MCODE分析，从KTR特异性PPIN中共提取了18个聚类，并选择了具有确定生物标志物目标的聚类2进行病因学研究。

        如图5所示，在KTR特异性聚类2中，确定的靶点相互作用，形成了调节免疫和干扰素相关途径的关键模块。其中HLA-A、HLA-C、HLA-G、IRF1/2和SP100分别受miR-23b-3p调控，其余三个为miR-155-5p的靶点。其中，HLA（人类白细胞抗原）是已知的人类主要组织相容性复合体（MHC）的表达产物，HLA的不匹配是影响肾脏异体移植功能和增加排斥反应机会的一个风险因素。作为HLA I类重链的三个重要成员，HLA-A、HLA-C和HLA-G在本研究中被发现有可能受到miR-23b-3p的调节。这里HLA I类分子在免疫系统中具有核心功能，它们可以通过来自内质网腔的呈递肽被细胞毒性T细胞检测到。因此，miR-23b-3p/HLA/免疫轴的信号传递为KTR的产生提供了新的见解。除了HLA组，ICAM1和VCAM1在移植肾脏的功能中也被充分研究。最后，IRF1是一种转录因子，它在KTR中介导MHC诱导和调节对坏死的抵抗，这对于干预排斥反应至关重要。

图5    与KTR发展相关的关键miRNA-mRNA调控模块和推测机制

四、结论

        在这项研究中，基于多组学网络特征的综合生物信息学模型，共筛选出三个miRNAs，即miR-145-5p、miR-155-5p和miR-23b-3p，作为诊断和亚型化肾移植后异体移植排斥的候选生物标志物。通过计算发现HLA相关基因的潜在调控机制、免疫信号通路和确定的miRNAs，以了解致病原因。