Cancer Discov | 多模态数据分析鉴定恶性脑肿瘤的基因组和免疫多样性
原创 huacishu 图灵基因 2022-01-13 10:55
收录于话题#前沿生物大数据分析
撰文：huacishu
IF=39.391
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亮点：
1、作者对来自 30 名患有原发性或复发性胶质瘤或转移性脑肿瘤的患者队列的93个样本进行了系统和全面的多部门免疫基因组学分析，这些患者是迄今为止最大的脑癌队列；
2、对于每位患者，作者使用全外显子组测序 (WES)、自定义捕获验证、RNA 和 TCR测序来表征多个空间不同的区域；
3、作者的发现强调了胶质瘤和转移性脑肿瘤之间克隆结构的显著差异，这种差异转化为不同的新抗原景观，进而转化为肿瘤浸润性T细胞克隆型多样性。
华盛顿大学医学院Gavin P. Dunn教授在国际知名期刊Cancer Discov在线发表题为“Characterization of the Genomic and Immunological Diversity of Malignant Brain Tumors Through Multi-Sector Analysis”的论文。尽管人们在继发性脑转移方面取得了一些成功，但靶向或免疫治疗对原发性脑恶性肿瘤如胶质母细胞瘤（GBM）的疗效仍然有限。虽然GBM的肿瘤内异质性与治疗耐药性有关，但目前尚不清楚这种多样性是否在脑转移瘤中观察到，以及癌细胞内在异质性在多大程度上影响局部免疫微环境。在此，作者通过全外显子组、RNA和TCR测序分析了30例恶性脑肿瘤中93个空间不同区域的免疫基因状态。分析确定了原发性和继发性恶性肿瘤之间的差异，胶质瘤在基因组和新抗原水平上表现出更多的空间异质性。此外，这种空间多样性在T细胞克隆的分布中得以重现，其中一些胶质瘤具有高度扩展但空间受限的克隆型。这项研究定义了恶性脑肿瘤队列中的免疫组学景观，并包含了针对颅内恶性肿瘤的靶向和基于免疫的治疗设计的含义。
从30例经病理证实的颅内肿瘤患者中获得手术切除的肿瘤组织和匹配的外周血。在该队列中，14个肿瘤为原发性GBM，4个为复发性GBM，1个为间变性少突胶质细胞瘤，11个为来自肺、乳腺或皮肤恶性肿瘤的脑转移瘤（BrMETs）。总的来说，这些患者中有21例是新诊断的，并且之前没有接受过治疗。4例复发性GBM患者接受了标准的化疗放疗，5例BrMET患者接受了不同的原发肿瘤治疗方案。重要的是，没有患者曾接受过免疫治疗，但队列中的所有患者均接受了术前类固醇治疗。在通过开颅手术进行手术切除后，立即将每个样本分离为多个空间上不同的肿瘤区域，每个区域都进行了全面的基因组和免疫学分析，包括DNA WES、RNA测序、新抗原预测和TCR测序（图1a）。使用平均覆盖深度为156x的WES，在整个肿瘤队列中共识别出11923个体细胞变异。正如预期的那样，BrMETs中每个肿瘤聚集体细胞变异的中位数高于原发或复发性胶质瘤(图1 b)。在神经胶质瘤组中，GBM065代表了在4个不同肿瘤区域识别出的5,750个体细胞突变的异常值。该样本中的大多数变异显示了与先前的替莫唑胺治疗相关的特征突变，表明是治疗诱导的高突变表型。在BrMET标本中，TP53在所有组织学中均发现了反复突变(图1c)。KRAS改变在2/5的NSCLC肿瘤中被发现，PIK3CA突变在2/4的乳腺癌中被发现，这与他们在原始样本研究中的高发病率相一致。此外，在黑色素瘤和非小细胞肺癌BrMET肿瘤中均观察到TERT启动子突变。在整个GBM样本中，发现典型的GBM相关基因如TERT启动子、TP53、PTEN、NF1和EGFR的反复突变(图1d)。接下来，评估了队列中拷贝数改变(CNAs)的发生率，并确定相关变化，如包括EGFR的7号染色体扩增频繁，CDKN2A位点的9号染色体缺失，以及PTEN位点的10号染色体缺失(图1 e)。转移性肿瘤表现出与之前定义的原发肿瘤相似的改变，如NSCLC中KRAS扩增，乳腺癌中ERBB2扩增(图1f,g)。。
在描述了胶质瘤和BrMET队列中的所有变异后，接下来作者试图描述所有肿瘤中瘤内基因组异质性的程度。首先，将每个样本中的所有变异分为“克隆型”(存在于肿瘤的所有测序区域)、“亚克隆共享型”(存在于肿瘤的多个区域但不是全部)和“亚克隆私有型”(只存在于肿瘤的一个区域)。观察到不同肿瘤类型之间的显著差异，BrMETs中克隆变异部分明显大于胶质瘤(图2a,b)。重要的是，这一观察与原发性恶性肿瘤的组织学无关，因为肺、乳腺和黑色素瘤转移瘤中都有很高比例的克隆变异。相比之下，与BrMETs相比，胶质瘤含有更高比例的亚克隆共享变异和亚克隆私有变异(图2 b)。总的来说，胶质瘤队列中大约43%的突变被归类为克隆突变。针对癌症驱动基因，所有BrMET样本中TP53、PIK3CA和KRAS的突变均为克隆型。与神经胶质瘤的普遍异质性相反，绝大多数TERT启动子、TP53和EGFR突变是无性分布的。然而，大多数PTEN和NF1改变在胶质瘤中不是克隆性的。这些发现在很大程度上与之前的多部门测序研究一致，该研究注意到TERT启动子和TP53突变具有显著的克隆性。与原发神经胶质瘤相比，在单个部位取样时，BrMETs中总变异的比例更高(图2c)。考虑到单点采样在捕获胶质瘤肿瘤变异信息方面的局限性，作者确定了多区域测序在多大程度上可以导致队列中额外的肿瘤变异的识别。在BrMETs中，额外取样的肿瘤区域并没有发现明显更多的变异。然而，在神经胶质瘤样本中，对三个区域而不是一个区域进行测序，可识别变异的中位数从61增加到98(图2d)。因此，神经胶质瘤的多区域测序获得了更完整的基因组图谱，但由于BrMETs的空间基因组同质性增加，只能对其特性进行有限的改进。当我们将每个CNA事件分类为克隆、亚克隆共享或亚克隆私有时，发现BrMETs中有相当一部分克隆CNA，而胶质瘤中主要是亚克隆CNA(图2e)。因此，在变异和CNA水平上，神经胶质瘤明显比BrMETs更具空间异质性。
为GBM和其他脑癌开发个体化新抗原疫苗的众多临床试验正在进行中。为了确定肿瘤遗传异质性对每个肿瘤免疫特征的影响，应用pVacSeq新抗原预测管道来定义所有胶质瘤和BrMET样本的新抗原景观。当汇总所有样本区域中每个肿瘤的预测新抗原总数时，BrMETs中每个肿瘤的HLA I类新抗原数量高于原发或复发性胶质瘤。此外，BrMET I类新抗原明显比在胶质瘤中发现的更具有克隆性(图3a,b)。值得注意的是，所有EGFR突变确实产生了预测的I类克隆新抗原。然而，尽管所有人都携带IDH 1R132H突变，队列中的4例IDH突变患者中只有1例具有这种突变的I类新抗原，显示这些结果的HLA依赖性。BrMETs也比原发性或复发性胶质瘤表现出更多的HLA II类新抗原，并且这些新抗原在肿瘤分布中明显具有更多的克隆性。对于大多数患者，I类和II类新抗原的空间分布与潜在的变异分布密切相关。最后，尽管BrMET HLA I类新抗原大多通过单点组织采样捕获，但随着更多的组织采样，更多的胶质瘤新抗原继续被识别(图3c)。综上所述，这些数据表明，与BrMETs相比，新抗原在胶质瘤中分布不均。除了新抗原，癌症/睾丸(CT)抗原是另一组可以被免疫系统识别的肿瘤特异性抗原。这些抗原在正常组织中高度受限表达，可在生殖细胞中表达，在恶性肿瘤中经常上调。尽管CT抗原在一系列临床试验中都是靶向性的，但它们在脑癌中的表达和分布尚未被描述。因此，在肿瘤队列中寻求CT抗原表达和空间分布的特征。由于CT抗原是野生型蛋白，正常的组织表达既影响定向免疫治疗的预期脱靶效应的程度，也影响发展过程中免疫耐受的程度。因此，根据相对于正常脑组织的CT抗原的对数转化表达，从一个精心整理的CT抗原列表中对每个候选抗原进行了评分。在神经胶质瘤中，一些评分最高的CT抗原为BIRC5 (Survivin)、PMEL (gp100)和IL13RA2(图3d)。虽然在BrMET样本中，BIRC5也是得分最高的抗原，但与胶质瘤相比，他们表现出许多显著的CT抗原，如MAGE家族蛋白、gp100、MART1和HER2/neu的表达相对较高。然而，在带有TERT、CTAG1B (NY-ESO-1)的CT抗原之间，这些特征确实存在差异，而MAGE家族比具有更多克隆性的BIRC5和gp100更倾向于瘤内变异(表达的异质性更大)(图3e)。
接下来，作者试图定义每个肿瘤内的免疫细胞浸润，并描述局部免疫微环境中肿瘤内异质性的程度。采用了之前发表的免疫反褶积方法，该方法从转录数据中解析免疫细胞群，以描述有足够RNA生成RNA测序数据的80个肿瘤区域。计算了所有区域的免疫评分，并观察到“CD8 T细胞”和“细胞毒性细胞”评分之间存在显著的肿瘤间变异(图4a)。令人惊讶的是，没有发现神经胶质瘤和BrMET样本区域之间的总体免疫评分有显著差异。为了更详细地探索潜在的差异，接下来对胶质瘤和BrMETs的肿瘤区域进行了差异基因表达分析。与BrMETs相比，检测到胶质瘤中CD274 (PD-L1)水平显著升高，CXCL9水平显著降低，这与前者的严重免疫抑制相一致(图4b)。虽然在胶质瘤中观察到免疫抑制M2表型的轻微极化，以STAT3和MRC1(CD206)的高表达为特征，确定了巨噬细胞个体发生中的主要区别。具体来说，与胶质瘤相比，BrMETs明显倾向于表达与单核细胞来源的巨噬细胞相关的基因，而这些基因富含小胶质细胞特异性基因(图4c)。这与最近在该领域使用单细胞分析的工作是一致的。最后，通过评分评估肿瘤内免疫异质性的程度。对至少三个部分的所有RNA肿瘤的免疫评分进行了主成分分析。在绘制PCA空间中的每个区域时，发现来自同一肿瘤的大多数区域聚集在一起(图4d)。总的来说，这些数据表明，神经胶质瘤和BrMETs之间免疫微环境的瘤内空间变异相似，通常小于瘤间变异。
为了评估GBM和BrMET肿瘤样本的浸润T细胞群中TCR克隆型的多样性、异质性和克隆扩展程度，对队列中的22个肿瘤的65个区域进行了TCR测序。TCRβ-chain互补性决定区域3 (CDR3)具有高度多样性，在抗原识别中起着重要作用。因此，当它们被激活并在肿瘤内进行克隆扩展时，TCRβ-链CDR3序列可以作为单个T细胞克隆的唯一条形码。将每个肿瘤区域内的克隆型分为显性克隆(克隆1)或基于频率的预定克隆型组(图5a)。出乎意料的是，在GBM内观察到大量的克隆扩增。相比之下，在已测序的BrMETs中，只有1个来自BrMET025 (NSCLC)的区域含有显性T细胞克隆。总的来说，BrMETs中所有细胞中的T细胞比例显著较高，而GBM中的TCR组合被确定具有更高的克隆度(图5 b)。为了研究肿瘤内T细胞库异质性的程度，接下来研究了每个肿瘤内前10个克隆的分布。TCR在每个肿瘤内的分布在患者之间差异很大，一些患者在所有检查区域中表现出显著的T细胞同质性，而另一些患者在肿瘤内表现出深刻的多样性（图5c）。一些GBM具有特别的异质性，局部扩增的T细胞克隆在肿瘤的一个区域出现的频率大于10%，但在所有其他区域出现的频率明显小于1%。然后，使用Morisita重叠指数（MOI）在全谱水平上通过两两比较对这种多样性进行量化，MOI是一种基于共享序列数量及其相对频率的群体间相似性度量。正如预期的那样，不同患者的MOI值接近0（无相似性），但在患者内部是可变的（图5d）。因此，GBM内变异和新抗原的空间异质性增加在TCR基因库水平上得到了重现。最终，为了进一步验证扩增的克隆在肿瘤组织中特异性富集，对其中8名患者的外周血进行了TCR测序。正如预期的那样，外周血T细胞（PBMC）的克隆性比匹配的TIL低。有趣的是，在BRMET中PBMC和TIL之间的相似程度似乎比GBM中更大，这可能暗示转移性疾病患者的系统免疫反应更强。追踪每名患者中高度扩增的肿瘤内克隆证实，大多数克隆可在外周血中检测到，但频率显著降低。
鉴于研究超突变GBM基因组学的文献不断增加，以及对显示该基因型的肿瘤是否对免疫治疗方法更敏感的持续评估，作者描述了具有该表型的肿瘤的免疫组学特征。在此期间，患者接受了四个周期的长春新碱、CCNU和丙卡巴嗪、质子放射治疗，以及六个周期的大剂量替莫唑胺（TMZ）（图6a）。使用4个肿瘤区域的DNA WES，观察到复发肿瘤所有区域的突变负担显著增加（图6b）。对复发肿瘤内突变特征的分析显示，特征11显著富集，已知与先前使用TMZ治疗相关，先前报道在过度突变的复发性胶质瘤中富集。作者观察到，在复发性肿瘤的每个区域内鉴定的绝大多数变异是亚克隆私有的，并且没有空间分布（图 6c）。一小部分（总共30个）变异在复发肿瘤的所有区域之间共享，甚至更少（总共15个）由原发灶和所有复发部分共享。重要的是，这些包括肿瘤的可能驱动因素，如 TP53 和 IDH1 改变。值得注意的是，GBM065.Re 内的前三个T细胞克隆型占肿瘤库的37%以上，表明克隆扩增的程度很高。此外，这些显性克隆都以降低的频率存在于患者外周血中，证实了这些细胞的特定瘤内扩增（图 6d）。最后，更深入地表征 GBM065.Re 的免疫学特征，在手术切除后立即对从该肿瘤中分离的分选CD45+免疫细胞进行了单细胞RNA测序（scRNA-seq）和 TCR 富集。发现大多数细胞属于淋巴谱系，主要是细胞毒性CD8+ T细胞（占测序细胞的59%），具有较少的CD4+调节样T细胞群（图 6e）。通过大量TCR测序鉴定的高度扩增的T细胞克隆也出现在scRNA-seq数据中，但发现它们分散在整个CD8+ T细胞簇中，表明这些克隆群体之间存在异质基因表达模式。对超扩增克隆型进行了差异表达分析，发现它们富含激活标记物，例如 KLRC3、KLRC4 和 GZMK，以及由激活的T细胞上调的MHC II 类基因（图6f）。因此，尽管在变异和新抗原水平上存在很大的异质性，但超突变的 GBM065.Re包含克隆扩增的T细胞，其活化表型分布在整个肿瘤中。
总体而言，这项研究以多部门方法提供了恶性脑肿瘤的免疫基因组学分析，展示了神经胶质瘤内的大量肿瘤内异质性，同时突出了BrMET之间令人惊讶的同质性。这些区别适用于癌细胞内在（基因组改变）和癌细胞外在（TCR 库）特征。对肿瘤免疫微环境的日益了解及其空间复杂性可能会提高免疫治疗对恶性脑肿瘤患者的疗效。
教授介绍
Gavin P. Dunn教授就职于华盛顿大学医学院，尽管广泛的基因组分析揭示了许多癌症类型中的肿瘤细胞脆弱性，但由于这些肿瘤内部的巨大异质性，这种方式尚未扩展到胶质母细胞瘤。与传统的靶向治疗方法相比，基于免疫的策略可能特别适合于治疗这些肿瘤，因为免疫细胞可识别的抗原具有难以置信的多样性。Gavin P. Dunn教授的实验室致力于在临床前和转化环境中理解胶质母细胞瘤免疫反应的分子和细胞基础，以及阐明胶质瘤基因组学和免疫原性之间的关系，这一领域被称为“癌症免疫基因组学”这些研究得到了该领域正在进行的临床试验的补充。
参考文献
Schaettler MO, Richters MM, Wang AZ, et al. Characterization of the Genomicand Immunologic Diversity of Malignant Brain Tumors through MultisectorAnalysis. Cancer Discov. 2021;10.1158/2159-8290.CD-21-0291.doi:10.1158/2159-8290.CD-21-0291