Protein Kinase D1, Reduced in Human Pancreatic Tumors, Increases Secretion of Small Extracellula...

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摘要：胰腺肿瘤细胞释放含有脂质和蛋白质、RNA和DNA分子的细胞外小泡(SEV，Exosome)，这些小泡可能促进转移的形成。目前还不清楚这些小泡包含什么货物，以及它们是如何释放的。蛋白激酶D1(PRKD1)抑制细胞运动，被认为在胰腺导管腺癌(PDAC)中调节失调。我们调查了它是否调节胰腺癌细胞中SEV的产生，以及它们在小鼠胰腺癌细胞中形成转移前利基的能力。方法：我们分析UALCAN和人胰腺组织微阵列的数据，比较肿瘤组织和非肿瘤组织中PRKD1的水平。我们研究了胰腺特异性PRKD1缺失的小鼠(PRKD1KO小鼠)、表达致癌KRAS的小鼠(KC小鼠)和PRKD1缺失的KC小鼠(PRKD1KO-KC小鼠)。从Panc1细胞在NSG小鼠体内种植异种皮下移植瘤，然后给一些小鼠注射SEV。对小鼠胰腺和肺组织进行组织学、免疫组织化学和/或定量PCR分析；对血浆SEV进行纳米颗粒示踪分析。用CRISPR-Cas9干扰Panc1细胞的Prkd1基因，或用小发夹RNA击倒Prkd1基因，或用选择性抑制剂CRT0066101抑制PRKD1的活性。用基因表达芯片、定量PCR、免疫印迹和免疫荧光等方法对胰腺癌细胞系进行分析。用流式细胞仪、透射电镜和质谱分析Panc1细胞分泌的SEV。结果：人PDAC组织中PRKD1的表达水平低于非肿瘤组织。与KC小鼠相比，PRKD1KO-KC小鼠发生胰腺上皮内瘤变的速度更快，肺转移更多，平均生存时间显著缩短。PRKD1KO-KC小鼠血清SEV水平高于KC小鼠。PRKD1缺失或被抑制的胰腺癌细胞SEVS分泌增加；PRKD1缺失降低其底物皮质肌动蛋白磷酸化，导致质膜F-actin水平升高。来自PRKD1表达缺失或降低的细胞的SEV改变了含量，与表达PRKD1的胰腺细胞的SEV相比，将这些SEV注射到小鼠体内增加了异种移植瘤向肺的转移。PRKD1缺陷的胰腺癌细胞显示整合素α-6-β-4在SEV中的负载量增加-这一过程需要CD82.

背景介绍：蛋白激酶D(PKD)家族的丝氨酸/苏氨酸激酶在调节肿瘤生长和侵袭性中起关键作用，例如通过刺激基质金属蛋白酶分泌。PKD已被认为通过诱导腺泡细胞重编程(ADM)来推动PDAC的癌变。然而，PRKD1亚型在体外抑制PDAC细胞的运动和侵袭。PRKD1在浸润性乳腺癌中通过启动子甲基化下调。因此，PRKD1-Lost通过调节肌动蛋白动力学增强了乳腺癌细胞的侵袭性。但是在胰腺癌中没有研究过，所以，作者就来了。

首先，通过在线网站先看看不同肿瘤的PRKD1表达情况，发现为抑癌基因，以前研究发现这个基因甲基化是失活的原因，因此，做也在数据库中验证了一下，在人组织中验证了一下，发现巨大多数为低表达。作者在KC鼠中特异性敲除胰腺的PRKD1，并没有发现其他PKD亚型未见改变，发现PRKD1的敲除增加了PAINS的数量，并加速了5月龄肿瘤的形成。

同时发现敲除PRKD1促进了肺转移，并且与肿瘤预后呈负相关。

紧接着，作者就想了解了一下PRKD1敲除后的生物学改变，用CRISPR-Cas9删除了Panc1细胞中的PRKD1、-2和-3，发现PrKD1mRNA的缺失与“EMT信号”、“癌症”、“细胞运动”和“分子运输”的调控显著相关。对EMT前标记进行了qPCR，显示Prkd1Crispr细胞中Cdh2、ZEB2、Vimentin(Vim)、纤维连接蛋白(FN)、MMP14、MMP7和MMP2的表达显著上调。Prkd1Crispr细胞TCL分析显示Cdh2、VIM、MMP14和MMP2显著上调，而Cdh1无明显变化，与KC肿瘤相比，PRKD1、KO、KC胰腺肿瘤的ZeB、FN和VIM表达上调，而CdH1表达下调。也就提示了PRKD1敲除在细胞和组织水平都有促进EMT的过程。FunRich3.13未加权的细胞成分分析(http://funrich.org)，发现了细胞外囊泡这个过程显著富集，所以，PRKD1敲除可以改变细胞外囊泡的分泌以及调控肿瘤的EMT过程发挥侵袭、转移作用，作者为了验证以上分析结果，可进行了外泌体蛋白CD63标记，并且进行流式细胞恩分析，发现敲除PRKD1后外泌体增多了，挽救实验，发现补充PRKD1可以减少外泌体的分泌，通过排除GRP94-外泌体污染来验证SEV制剂的纯度。敲除PRKD1并没有改变外泌体的外型，但是，外泌体的浓度增加了四倍，PKD其他的家族成员未见有改变外泌体分泌的表型变化。

肿瘤组织虽然低表达PRKD1，但是并不是完全没有，作者通过半稳态多克隆Panc1细胞中检测了PRKD1表达降低对shRNAs分泌SEV的影响。敲减后蛋白水平降低74%，达到了人组织这个蛋白的表达水平，然后，发现panc1细胞外泌体分泌明显增多，这个蛋白在人组织中具有催化功能，通过抑制催化功能，这个蛋白可以发生自动磷酸化，并且通过抑制其催化活性，可以增强人胰腺癌细胞系的外泌体释放，在肺癌和大肠癌中也可以观察到类似的表现。（补充材料，没有找到，不好意思）

以上是细胞水平的炎症，然后，作者又在体内看了看，发现敲了PRKD1后血中外泌体也相应增多了，上图K-M.

接着，作者开始探讨PRKD1调控外泌体的机制，这种激酶要发挥作用首先需要底物，通过将底物磷酸化，从而发挥效应，那么这个底物是什么玩意儿。

因为这个蛋白影响了外泌体分泌，所以看看外泌体分泌相关的蛋白表达情况，发现，RAB5-Q79L的SEV生物发生不受PRKD1-Lost的影响，质膜上的分支肌动蛋白细丝对SEV的分泌很重要。用Pearson共定位系数(PCC)进行定量共定位表明，在Prkd1Crispr细胞中，外周CD63阳性结构上的F-actin显著增加，表明Prkd1Crispr细胞中的MVBs增多。Prkd1Crispr细胞中，肌动蛋白的聚合显著增多，Cortactin促进肌动蛋白聚合并保护肌动蛋白不去分支，并且PRKD1使Cortactin磷酸化。这种磷酸化削弱了与WASP-家族成核促进因子(NPFs)协同作用的肌动蛋白聚合。Cortactin不影响外泌体的生物发生。Cortactin是一种弱的II类成核促进因子，但可以通过Arp2/3-复合物与I类NPF(如WAVE1/2或N-WASP)协同促进成核。Cortactin与WAVE2共定位于细胞膜动态肌动蛋白结构调控PDAC癌细胞运动，SiRNAs抑制WASF2(WAVE2)显著降低Panc1细胞SEV分泌，在siRNA介导的CTTN(Cortactin)KO也显示出类似的效应。

接着，作者看了看ESCRT是否参与到了PRKD1敲除对外泌体分泌的影响，Prkd1Crispr细胞显示RAB5家族成员RAB31和RAB11a的表达显著上调，特别是后者表明利用了ESCRT非依赖的生物发生。另一方面，RAB27a和RAB27b(ESCRT依赖的)显著下调，再次表明在PRKD1耗尽时SEV分泌途径的利用转向ESCRT非依赖的SEV生物发生（也是补充材料，没有下到）

因为在前面的分析结果发现EV可能通过细胞信号转导的方式参与细胞侵袭、转移过程，作者发现敲减PRKD1的肿瘤细胞系侵袭能力更强，并且在肿瘤摄取外泌体上没有发生改变，但是，亲本细胞在摄取了PRKD1KO鼠的外泌体后会促进肿瘤侵袭。（补充材料）

因为外泌体所引发的生物学行为可能与其货物相关，故而，作者做了质谱分析，发现在Prkd1CrisprSEV中有37个蛋白质显著上调，120个蛋白质下调。手动筛选促进侵袭和/或转移的潜在相关蛋白显示，Tenascin-C(TNC)和GPC-1在Prkd1Crispr SEV中强烈上调。这两个蛋白在胰腺癌中上调，并与PDAC细胞的迁移和侵袭有关。TNC也存在于肿瘤细胞来源的SEV中，并且可以在PDAC细胞中诱导EMT。TNC高度富集PRKD1缺失细胞分泌的SEV。这些SEV能够诱导Panc1细胞的部分EMT，表现为间充质转录物(CdH2，Vim，ZEB2)的上调。

紧接着就是外泌体促进肺转移的研究了。作者在PRKD  KO的KC鼠中发现肺转移增多，结合既往的研究整合素在肿瘤转移器官特异性上的成果，α6β4与肺转移相关，而αvβ5促进肝转移，MS表明，Itg-β5在Prkd1Crispr SEV中显著下调，而Itg-β4上调。Prkd1Crispr-细胞的基因表达分析也显示Itg-β5的下调和Itg-β4的上调，发现PRKD1敲除的基因与α6β4靶基因存在一致性，Itgs-β4、-β5、-α6和-β1的定量PCR结果显示，肝脏靶向性的Itg-β5在Prkd1Crispr细胞中表达显著下调，而Itgs-β4和-α6的表达显著上调。从相同细胞数获得的整合素在TCL和SEV中的表达分析表明，ITG-α6和-β4在Prkd1Crispr细胞和SEV中的表达强烈上调。但是肝转移相关的整合素av没有变化

细胞做完看动物，看完动物看临床，结果证实敲减了PRKD1后确实增加了外泌体整合素a6b4的表达，并且在人体中a6的组织表达水平与预后相关。

作者又分析了肿瘤细胞是通过什么机制增加了外泌体中的整合素水平的。在细胞中，表面蛋白被内小体规律性地内化，这些内小体融合成MVB，在那里表面蛋白被结合到腔内小泡(ILV)、SEV(外泌体)中。通过这种机制，可以从质膜回收四肽及其相关分子，作者在外泌体上证明了这些整合素蛋白的高表达，TSPAN-8、CD82和CD151特别与ITG-α6β4 的α亚基相关，且CD82的高表达，CD82也显著富集于TSG101阳性的MVBs，并且细胞中更多，有趣的是，CD82被描述为一种转移抑制因子，CD82-表达下调与许多人类癌症的晚期相关，作者认为CD82下调与外泌体释放增多有关。

通过敲减CD82发现外泌体的整合素减少，细胞的整合素增多，但是并没有影响外泌体的大小及浓度。

最后，作者做了体内实验证明胰腺癌PRKD敲除后外泌体可以促进肿瘤转移。研究了注射Panc1或Prkd1Crispr来源的SEV后，Panc1皮下肿瘤在NOD/SCID小鼠中的转移扩散，事实上，接受Prkd1Crispr SEV治疗的小鼠与对照组相比，CK19阳性肺转移的数量显著增加，而异种移植的体积和重量没有差别调节。通过对肺成纤维细胞摄取外泌体以及成纤维细胞活化表型研究，发现外泌体可以有效被CAF摄取并且促进活化，形成局部炎症微环境，促进肿瘤转移的作用，

Prkd1Crispr-Panc1细胞中s100a4、-a6、-a13和-a16转录本的表达也显著上调。此外，在Prkd1Crispr来源的SEV中，s100a4和s100a16mRNAs显著增加

阻断Prkd1Crispr来源的SEV上的ITG-α6显著减少了肺转移的数量。此外，用从Prkd1Crispr细胞挽救性PRKD1表达的SEV治疗小鼠显著削弱肺转移的形成，同时减少了细胞裂解液及外泌体中的整合素水平。

文章到此结束，虽然都是已知结果，但是，却做出了一个创新性的角度，在研究胰腺癌肝转移的背景下，作者另辟蹊径做胰腺癌肺转移，不得不说实在是高，欢迎批评、指正。