10X空间转录组重点分析合集

作者，追风少年i

马上中秋了，祝大家节日快乐，我们这一篇进行分析合集，回顾一下空间转录组的分析重点,包括8个部分

• CellphoneDB V3.0 助力空间转录组生态位通讯分析
• 10X空间转录组，空间位置带给了我们什么信息？
• 10X单细胞空间数据分析之表征细胞状态和生态型
• 全球首篇FFPE空间转录组研究文章揭示肾细胞癌中三级淋巴结构抗肿瘤机制
• 空间转录组之免疫组库分析
• 单细胞空间联合分析方法论
• 时空通讯分析导论
• 空间转录组聚类分析与生态位

CellphoneDB V3.0 助力空间转录组生态位通讯分析

2022年也马上要过去，空间转录组又陪伴我们走过了一年，这项2020年的年度技术，在生物组织研究的各个领域都有了广泛的运用，也提供了很多生物学研究的新角度，其实包括空间细胞网络、空间轨迹、空间共表达模块等等等等，其中，无论对于单细胞还是空间转录组，细胞之间的相互作用是绕不开的话题，组织是一个统一体，细胞之间不可能割裂的存在，而是存在广泛的相互交流，来维持组织的正常生物学功能。

单细胞研究细胞通讯已经有了广泛的案例，但是在缺少空间位置的情况下，尤其在多样本整合分析的时候，忽略了细胞之间距离远近和个体的影响，与此同时，越来越多的研究表明，细胞之间的相互作用很可能仅限于最近邻，在空间转录组的分析上，也明显发现，每个细胞类型都显示一个相对恒定的生态位特征。

基于此，很多研究人员开发了针对空间邻域通讯分析的分析软件，时下引用最多的单细胞通讯分析软件---CellphoneDB^[1]，也已升级到3.0版本，专门开发了针对空间生态的分析模块，我们来一探究竟。

CellphoneDB（V3.0）的创新点

1、合并空间信息 ，CellPhoneDB 现在允许通过微环境文件合并细胞的空间信息。 这是一个两列文件，指示哪种细胞类型在哪个空间微环境中（参见示例见下表）。 CellphoneDB 将使用此信息来定义可能的交互细胞对（即在微环境中共享/共存的clusters）。 可以使用 cell2location^[2] 定义具有先验知识、成像或 Visium 分析的微环境。

cell_type	microenviroment
epi_Ciliated	Proliferative
epi_Pre-ciliated	Proliferative
epi_SOX9_LGR5	Proliferative
epi_SOX9_prolif	Proliferative
epi_SOX9	Proliferative
Fibroblast eS	Proliferative
Lymphoid	Proliferative
Myeloid	Proliferative
Fibroblast C7	Proliferative

表1 空间转录组细胞微环境

2、添加了新的分析方法 使用差异表达基因 (DEG) 而不是 random shuffling（cellphonedb 方法 degs_analysis）。 这种方法将选择所有基因都由高于阈值的一小部分细胞表达并且至少一个基因是 DEG 的相互作用。 可以使用自定义的工具识别 DEG，并通过文本文件将信息提供给 CellphoneDB。 第一列应该是细胞类型/cluster，第二列应该是相关的基因 id。 其余列将被忽略（参见示例见下表）。

cluster	gene	p_val_adj	p_val	avg_log2FC	pct.1	pct.2
Endothelial	ACKR1	1.57E-88	7.48E-93	4.304509301	0.73	0.032
Endothelial	VWF	5.77E-87	2.75E-91	2.523726269	0.85	0.058
Endothelial	EGFL7	4.27E-77	2.04E-81	2.492629191	0.9	0.089
Endothelial	CCL14	1.64E-71	7.81E-76	1.913309933	0.61	0.009
Endothelial	CXorf36	2.00E-65	9.54E-70	1.569050164	0.68	0.022
Endothelial	ITM2A	4.73E-63	2.26E-67	2.132392002	0.81	0.061

表二 差异基因分析结果

3、Database update WNT pathway has been further curated. CellPhoneDB 考虑了大多数配体和受体的多聚体组成，这与 WNT 信号传导的复杂调控高度相关

图1 CellphoneDB扩展了数据库

CellphoneDB（V3.0）的运用案例

目前CellphoneDB（V3.0）已经得到了很好的运用，我们参考最新发表的文章Mapping the temporal and spatial dynamics of the human endometrium in vivo and in vitro^[3]，2021年12月份发表于Nature Genetics，IF 38.330，文中为了研究细胞在管腔和腺体间的相互作用，首先运用10X 空间转录组对组织区域进行分层聚类，发现WNT 和 NOTCH 信号通路的特征存在于不同的子宫内膜区域。参与 WNT 通路的基因 FOXJ1 和 LGR5 在管腔表面高度表达，而 NOTCH2在功能层的腺体中显著富集。为了验证上述结果，使用 smFISH 探针对目标信号基因进行染色，从而量化信号基因的表达与管腔的距离，结果发现，与腺体相比，NOTCH2 表达在远离管腔的腺体中增加，而 WNT7A 在管腔上皮中的表达高于腺体。相比之下，非经典 WNT 分子 WNT5A 主要在腺体周围的基质细胞中表达。这些发现表明，经典的 WNT信号在腺体微环境中被抑制。

图2 信号通路的空间表达特征

其次运用cell2location^[2] 的方法来识别细胞类型的生态位，定义了三个以上皮细胞为中心的子宫内膜微环境：

(1) lumenal—preciliated, ciliated and SOX9⁺LGR5⁺ epithelium (proliferative phase) and ciliated and lumenal (secretory phase)；

(2) functional—SOX9⁺ proliferative epithelium, immune and eS (proliferative phase) and immune, glandular and dS (secretory phase)；

(3) basal—SOX9⁺LGR5⁻ and fibroblasts C7

图3 单细胞空间联合分析识别空间生态位

然后结合空间位置的微环境来分析细胞类型生态位的相互交流，发现显著的上皮-基质相互作用，其中NOTCH信号主要由上皮细胞介导，但是高表达JAG1的上皮细胞却经常与表达HEY1但低水平表达JAG1的细胞相邻，表明严格的空间临近的细胞通讯；与此同时在分泌细胞谱系中WNT信号通路受到周围细胞的严格抑制，说明在细胞在空间位置上信号传导受到生态位的严格调控。

图4 空间通讯信号激活与抑制

细胞通讯分析的单细胞空间联合

其实对于生物学组织统一体的认知，主要体现在细胞与细胞类型时间上和空间上的严格调控，细胞类型不会是随机出现在任何位置，而是在恒定的时间，恒定的地点发挥其独特的作用，且受到周围微环境的影响。研究中也发现每种细胞类型都会匹配一个相对稳定的生态位，生态位对细胞之间交流的严格调控才是体现组织真正微环境的关键所在，而我们要实现对组织内部微环境的真正认知，不仅仅需要单细胞数据精确地告诉我们有哪些细胞类型，更需要空间转录组分析出细胞类型周围相对恒定的微环境，由此强强联合，才可对认知组织的有序性、疾病对组织的影响以及对临床运用方面提供有价值的参考。

[1]Efremova, M., Vento-Tormo, M., Teichmann, S. A. & Vento-Tormo, R. CellPhoneDB: inferring cell–cell communication from combined expression of multi-subunit ligand–receptor complexes. Nat. Protoc. 15, 1484–1506 (2020).
[2]Kleshchevnikov, V. et al. Comprehensive mapping of tissue cell architecture via integrated single cell and spatial transcriptomics. Preprint at bioRxiv https://doi.org/10.1101/2020.11.15.378125 (2020).
[3]Luz Garcia-Alonso. et al.Mapping the temporal and spatial dynamics of the human endometrium in vivo and in vitro.nature genetics.53, pages 1698–1711 (2021).

10X空间转录组，空间位置带给了我们什么信息？

2020年被Nature Methods评为年度技术的空间转录组，时至今日，陪伴我们科研人员已经2年了，在这期间，涌现了很多别具一格的分析角度，不断刷新着我们对组织空间理解。对于生物学组织而言，细胞空间位置分布的重要性不言而喻，对于细胞空间分布的研究，也是我们研究发育、疾病等等生物学问题最为重要的课题之一，其中最为关键的是，对于空间位置信息的认知，如何深入挖掘空间上的生物学内容，逐渐成为我们倚重的分析点。

目前对空间转录组位置信息的分析严重不足，典型如Seurat^[1],更多的基于每个spot的基因表达信息进行降维聚类等下游分析，几乎完全缺乏对空间信息的处理；也包括一些寻找空间高变基因的软件如SpatialDE^[2]、SPARK^[3]等，也仅仅是简单利用空间位置寻找基因在空间上的区域变化，完全无法满足科研人员对于组织有序性和不同细胞类型在空间位置上“协作”的研究;尤其对于细胞在空间上聚集的原因与作用，细胞在不同层面的“等级”变化等等，都在不断强调对空间位置信息的挖掘。前人栽树，后人乘凉，就让我们带着对空间位置信息的分析角度，目睹其带给我们的生物学认知。

分析点1、空间位置上的细胞“网络”

什么是细胞“网络”？细胞在空间位置上不是随机出现的，细胞在空间上的定位受到了周围环境以及自身状态的影响，而这种影响的结果，就是每种细胞类型在空间上形成了具有区域偏好性的细胞“网络”，在文章Spatial mapping reveals human adipocyte subpopulations with distinct sensitivities to insulin^[4]中,为了系统的确定白色脂肪组织（WAT）的细胞区域“网络”,计算了每种细胞类别中的空间位置彼此相邻的倾向，这里我们称之为同型细胞“网络”。文章的分析结果表明，所有免疫细胞、脂肪细胞祖细胞和血管细胞以及成熟脂肪细胞的同型细胞“网络”中都表现出很大的跨度，一些细胞类型几乎横跨整合组织区域，如图：

图1 同型细胞网络

同型细胞“网络”是为了确定单一细胞类型在空间上的分布特点，但为了确定不同细胞类别之间的空间关系，作者利用软件STUtility来执行成对的异型邻域分析，我们称之为异型细胞“网络”，用来衡量不同细胞类型之间的空间临近关系。如图：

图2 异型细胞网络

作者的研究发现，代表较大血管结构的Spot在血管样组织学特征上彼此靠近；并且发现特定祖细胞位于巨噬细胞附近并形成用于组织修复和重塑的脂肪生成生态位。

分析点2、探索细胞“单元”