文献阅读第一天

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正文开始：

文章题目：Targeting EZH2 reactivates a breast cancer subtype-specific anti-metastatic transcriptional program

靶标EZH2反激活乳腺癌特定亚型(Luminal B)的反扩增性转录机制

来源：2018 Nature Communications DOI: 10.1038/s41467-018-04864-8

第一部分：词句经典

Emerging evidence has illustrated the importance of...
Breast cancer is comprised of a variety of disease entities bearing diverse pathological features, prognostic outcomes and metastatic behaviours
In an effort to unravel, xxx(method) has led to...xxx(result)
xxx has particularly (adj. ) outcome, partly due to ...
However, functional studies have failed to reach a consensus as to whether Ezh2 plays a causal role in driving disease or is merely a by-product of increased cellular proliferation
underscores the importance of ...
Given that..., in this study we investigated... To this end, we employed... to
To further establish that..., and to gain insight into...
The results demonstrated that...
To further support the concept that...
Considered together, these data suggest that...
Our interest in pursuing... was driven by...

第二部分：文章结构

摘要前言：
表观遗传在肿瘤研究中意义重大，但是组蛋白修饰对于乳腺癌的发展作用机制尚不明确，另外组蛋白修饰过程在各个子型之间的发展差距没有被充分论证。本文发现：通过基因或药物靶向Ezh2，可以很大程度上抑制小鼠体内乳腺癌转移。进而研究了乳腺癌Luminal B子型的分子机制：甲基转移酶EZH2维持了H3K27me3(Trimethylation of lysine 27 on histone 3 )调控的FOXC1基因抑制，也因而抑制了FOXC1的反扩增性转录体系，导致乳腺癌细胞不断扩增。因此，尤其对于Lunimal B型患者而言，FOXC1表达量的增加有利于病情减弱，另外可以利用EZH2甲基转移酶抑制剂来控制肿瘤的转移。

搜集一些相关知识：
表观遗传 Epigenetics：非基因序列改变所致基因表达水平的变化，包括DNA甲基化、组蛋白修饰、染色体重塑和非编码RNA调控等，主要通过对基因转录或翻译过程的调控，影响其功能和特性。
【这里@基因叔叔讲解的很好】

DNA甲基化是指在DNA甲基化转移酶的作用下，在基因组CpG二核苷酸的胞嘧啶5'C位共价键结合一个甲基基团。
正常情况下，人类基因组“ 垃圾”序列【重复的、无翻译RNA能力的DNA，占据全基因组的98%以上，详细参考http://news.bioon.com/article/6702414.html】的CpG二核苷酸相对稀少，并且总是处于甲基化状态，目前在其中已发现多处潜在癌症病源；
基因组中大小为100—1000 bp 左右且富含CpG二核苷酸的CpG岛处于未甲基化状态的序列，与56% 的编码基因相关。人类基因组序列草图分析结果表明，人类基因组CpG岛约为28890个，大部分染色体每1 Mb就有5—15个CpG岛，平均值为每Mb含10.5个CpG岛，CpG岛的数目与基因密度有良好的对应关系， CpG岛甲基化会致抑癌基因转录失活

组蛋白全称是“组织蛋白”，是被DNA围绕的核内蛋白，他们共同形成染色质。当二者结合打开时，转录因子会结合到DNA上，促进表达；当二者结合太紧密，不愿分离时，基因表达当然就被抑制。影响二者结合能力的一个因素就是：翻译后修饰(Post-translational modifications)会改变组蛋白本身结构，包括蛋白乙酰化、甲基化、磷酸化、泛素化等。因此Chip-Seq就是为研究这类蛋白修饰而生的。

乳腺癌存在异质性【一种遗传性状可以由多个不同的遗传物质改变所引起】，利用全转录组分析得到了至少五种分子亚型： Luminal A, Luminal B, HER2+, Basal-like breast cancer (BLBC) and Normal-like

Liminal A 肿瘤发展很慢，预后(prognosis:医生预测病情的发展情况)最优；
Liminal B比A发展快，预后次之；
Basal-like：这种类型多见于携带BRCA1 gene 突变的女性患者，尤其是年轻的非裔美国女性。目前机制不明
HER2+：比Luminal型发展更快，预后较差，但是利用药物靶标HER2 protein治疗可行【有关的药物如：Herceptin (chemical name: trastuzumab), Perjeta (chemical name: pertuzumab), Tykerb (chemical name: lapatinib), and Kadcyla (chemical name: T-DM1 or ado-trastuzumab emtansine)】
Normal-like：与Luminal A型相似，预后较好但还不如Lunimal A

本文研究类型为Lunimal B型（以下简称B型）, 研究表明它比BLBC or HER2+ 中组蛋白甲基化H3K27me3更多，但是其中机理尚不明确。研究目标是Ezh2在B型中的作用，研究方法是：从小鼠组织损伤，癌细胞扩增到大规模癌细胞扩散的几个典型时期，通过移除Ezh2，看个体的生存情况。而后又研究了Ezh2与FOXC1的关系。FOXC1是转录调控因子，他负责监控基因是否不受调控地转录表达。结果表明，在Ezh2为主要诱因的肿瘤中FOXC1是沉默的。对FOXC1的功能进行进一步说明，设置的对照就是：FOXC1受抑制以及反激活的FOXC1的样本，结果发现癌细胞扩增的范围和数量在反激活的样本中大大降低，只要癌细胞转移受到抑制，癌症的致死率也会随之降低。

结论：

Ablation of Ezh2 impairs tumour onset and metastasis.
移除Ezh2基因可以减轻肿瘤形成与转移。
利用这个模型：Polyomavirus Middle T (PyVmT)-driven model ，可以基本拟合人体中肿瘤的发展。
目前研究较多的转基因小鼠模型有： ERBB2(erythroblast leukemia viral oncogene homolog2)、MMTV(murine mammary tumor virus)-ERBB2、 MMTV-PyMT(polyoma middle T antigen)、MMTV- wnt-1转基因小鼠模型等
- ERBB2基因编码 ERBB2蛋白，属于细胞生长因子受体家族，具有酪氨酸蛋白激酶活性，在20％～60％人类原发性乳腺癌的病例中有扩增或过表达或者变异，导致异常活化，刺激细胞增殖、发育分化、迁移，与乳腺癌发生发展及预后正相关;
  ERBB2转基因小鼠，主要是高表达ERBB基因同源(如ERBB2/ERBB2)或异源二聚体(如ERBB2/ERBB3)，这种异常活化的致癌基因在体内或乳腺组织高表达，导致小鼠发生乳腺癌等肿瘤
  - ERBB2的表达与乳腺癌的发生与预后相关，并与患者的预后呈负相关
- MMTV是导致小鼠乳腺肿瘤的重要病毒，在进行转基因动物模型时，并不是利用其致癌特性，而是利用其病毒组织特异启动子及增强子功能，调控癌基因ERBB2、PyMT、wnt-1在小鼠乳腺高表达而发生乳腺癌.【用MMTV乳腺特异表达癌基因的转基因乳腺癌模型较多用，尤其是 MMTV-PyMT转基因乳腺癌模型小鼠，该模型动物第8周开始发病，第14周达到晚期乳腺癌的水平，表现出与人类乳腺癌较为相似的病理改变，也是目前研究乳腺癌发病机制的理想模型】
  - MMTV- Wnt-1转基因小鼠发病率稳定，便于观察乳腺肿瘤发展进程的不同阶段，是抗乳腺癌药物研究和筛选的良好的动物模型；
  - MMTV-PyMT转基因小鼠利于观察乳腺癌在小鼠不同周龄的发展情况，并且这个肿瘤模型转移效率比较高，可以向肺部转移；
  - MMTV-ERBB2转基因小鼠是由小鼠活化的 ERBB2基因，以小鼠乳腺癌肿瘤病毒为载体，转基因形成的乳腺癌动物模型，是目前国际上作为乳腺癌病因学、预防研究的理想模型
- 以上两种方法不同，但是结果都使得致癌基因高表达，还有一种：抑癌基因敲除动物模型发生乳腺癌，常用的模型有：敲除小鼠抑癌基因Tp53、敲除乳腺癌抑制基因(breast tumor suppressor gene,BRCA)包括BRCA1和BRCA2敲除模型，以及上皮细胞钙黏蛋白(E-cadherin)与p53联合缺陷动物模型等
有趣的是，缺少Ezh2的肿瘤细胞利用免疫荧光检测肿瘤上皮组织中的H3K27me3，结果并检测不到，说明Ezh1并不能代替Ezh2。
另外，Ezh2的减少可以极大地降低肿瘤细胞向肺部的扩散能力。
Pharmacological H3K27me3 inhibition mimics genetic ablation
药物(GSK-126)抑制H3K27me3甲基转移酶模拟基因移除
GSK-126调控的抑制作用可以借助H3K27me3的免疫组化分析

免疫组化分析是利用已知的特异性抗体或抗原能特异性结合的特点，通过化学反应使标记于结合后的特异性抗体上的显示剂，如酶、金属离子、同位素等，显示一定的颜色，并借助显微镜观察其颜色的变化，从而在抗原抗体结合部位确定组织、细胞结构的化学成份或化学性质

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上面知道了GSk-126是作用于Ezh-2，那么对于肿瘤细胞能不能直接作用呢？为了进一步验证GSK-126的抗肿瘤转移作用是作用于肿瘤细胞，又选取了野生型（正常细胞）与Ezh2-null Tet-ON PyVmT 模型（肿瘤细胞但是其中的Ezh2无作用，排除了Esh2的影响），使用GSK-126处理后，野生型出现肺部扩散但是Ezh2-null没有。考虑到Ezh2在肿瘤形成初期以及扩散中都发挥了作用，而上面研究表明了GSK对扩散抑制作用明显，那么GSK-126能否对肿瘤在初期生长有作用呢？结果表明：GSK-126对肿瘤细胞初期生长作用不显著。

Identification of a Foxc1-driven anti-metastatic cascade.
鉴定抑制癌细胞转移的过程，想看看其中有哪些调控因子作用。其中最有研究价值的就是Forkhead Box C1, 因为它同时出现在了多种鉴定分析中，并且在晚期肿瘤的Ezh2上游显著调控。
对肿瘤晚期的H3K27me3进行了Chip-Seq分析，发现在Ezh2失活的细胞中转录起始位点结合降低，说明Ezh2能够维持H3K27me3；再结合转录组数据交叉分析，结果显示：约22%的差异上调基因是H3K27me3靶标因子，因此Ezh2可以间接调控这些基因。有趣的是，这些基因通过pathway富集分析，主要集中在细胞运动、组织形态产生等，其中就包括FOXC1。

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FOXC1也是个转录因子，能够独自调控它的靶标基因，从JASPAR数据库得到了23个推测的FOXC1靶标基因，在EZH2-null的样本中表达上调，同时还表示了各个基因与H3K27me3结合位点的富集情况(a)：
又利用了GO数据库找到了这些上调的FOXC1靶标基因的下游通路(b)

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Functional validation of Foxc1 anti-metastatic capacity

FOXC1下游有许多靶标元件，能够控制他们修复细胞的异常活动和扩增。
接下来就是FOXC1抗肿瘤转移的功能鉴定，采用RNA干扰敲除PyVmT 细胞中的FOXC1，同时用GSK-126处理，结果基本完全恢复了GSK处理前的样子，说明在抑制FOXC1会加速H3K27me3调控的基因沉默，加快肿瘤细胞扩散。
Differential association of elevated FOXC1 across subtypes

验证了EZH2和FOXC1之间的关系：测了20个B型病人FOXC1的mRNA表达量呈显著正相关，转录后蛋白水平EZH2和FOXC1负相关，因此佐证了B型中EZH2调控FOXC1表达抑制。
各个亚型与FOXC1的关系是：高表达的FOXC1使得B型和HER2+型病人旧病复发的风险降低，存活率提高；
BLBC型没有改善；A型存在很大的改善可能性

因此总结为一句话：FOXC1 plays a tumour suppressive role in non-BLBC subtypes

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几种亚型的EZH2与FOXC1表达量差异：这是抑制了Ezh2甲基转移酶的活性后，各个类型肿瘤的扩散能力，很明显，只有在B型和HER2+型中高水平的EZH2表达量才对应低水平的FOXC1；左图中利用PAM50基因表达来分析确定肿瘤的固有亚型

EZH2-mediated metastasis suppression is Luminal B specific

总的来说，B型致癌基因(oncogene)EZH2作用途径与被抑制途径效果如图：

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第三部分：总结

全文的核心就是分析一个机制： B型乳腺癌的致癌基因EZH2对于FOXC1基因的抑制调控，进而导致肿瘤扩散

这些发现临床上可以用于EZH2甲基转移酶抑制剂的应用，毕竟这个致癌基因还是广泛存在的，所以医疗前景广阔

FOXC1基因的作用也是至关重要，它的表达量升高，会显著提高非BLBC亚型的预后效果，尤其对于B型会显著抑制肿瘤扩散【即存在亚型选择性，很好的预后biomarker】，另外FOXC1的一些靶标基因也能对A、B、HER2+型患者产生较好的预后，因此FOXC1的下游调控也对肿瘤存在抑制作用。在B型条件下，这些靶标基因与神经元的形成也有关系。

本文使用的试验方法：

orthotopic transplantation（原位移植）、ShRNA silencing 、Immunofluorescence 、Immunoblotting 、RNA isolation, cDNA synthesis and qRT-PCR 、Microarray data acquisition 、
Chromatin immunoprecipitation （Chip-Seq）

Chip-Seq 分析：
五种亚型构建混池构建DNA文库，使用Illumina2000单端测序得到50bp的reads，下机得到的raw data先trim过滤（ $length \geq 32$ ）,质量值( $phred\geq30$ ) ,去接头用的是fastx v0.0.13.1 。BWA比对到小鼠参考基因组mm10。MACS v1.4.1进行peak calling（mfold = 10,30; bandwith = 300; p-value cutoff = 1E-5 ）。bedtools找peak列表交集，存在1个碱基的重叠就认为binding peaks是overlapping的。注释用的HOMER v3.18。

Data Availability：
Microarray and ChIP-Seq data sets have been deposited in the GEO database at NCBI. All data sets in this study are available under GEO108861 and GSE108899.

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