非因解读 | RPPA在肿瘤细胞系中药物靶点蛋白检测的大规模应用

                                                                       RPPA在肿瘤细胞系中药物靶点蛋白检测的大规模应用

癌症作为多基因的高度克隆异质性疾病，在不同的肿瘤条件下，对药物治疗反应往往是不同的。在过去的二十年中，靶向肿瘤细胞作为癌症分子生物学研究领域最为火热的方向，已经产生大量的研究成果，同时推出了针对十多种靶点的100余种肿瘤靶向药物，对肿瘤治疗和提升病人生存产生了巨大影响。然而，伴随而来的耐药性则成为亟待解决的重要问题，从机理层面上的研究也未曾达到系统性的高度，而这些信息将为我们了解复杂的癌症发生、发展和耐药性机制提供了宝贵的资源。

目前用于系统性分析评估癌症-药物作用和机理的方法并不完善，技术和方法学都受到挑战，非因生物的RPPA靶向蛋白组学技术正好弥补了这个缺口。作为一种高通量的多重蛋白靶点分析技术，可实现大规模样本的几百种肿瘤信号靶点平行分析；同时RPPA具有其它高通量蛋白组学所无可比拟的超高灵敏度，可在40微克总蛋白或15毫克组织中（米粒大小）分析＞300种低丰度蛋白，包括大量细胞信号蛋白、免疫通路蛋白、修饰蛋白（磷酸化，乙酰基化，甲基化）等。RPPA技术在定量能力、重复性、大样本分析比对能力上的优势，是其它蛋白组学技术手段所不具备的。RPPA技术能够高通量平行检测药物靶点及相关蛋白位点扰动情况，成为了解决癌症和药物相互作用的关键技术之一。

来自MD Anderson的Gordon B. Mills研究团队，利用RPPA技术大规模探究药物处理后药物靶点及相关蛋白位点扰动情况，并于2020年12月在《Cancer Cell》杂志上（IF：26.602）发表题为“Large-Scale Characterization of Drug Responses of Clinically Relevant Proteins in Cancer Cell Lines”的文章（图1），该文章通过RPPA技术建立了药物和蛋白作用位点的连接图谱，为预测药物有限性和抗药性产生机理提供了丰富的资源。

图1

技术亮点

Mills研究团队利用RPPA技术平台的高通量特性，实验处理了涉及319种细胞系与168种药物的关系，得到了11884份药物处理样品和3608份对照样品，共计15492份样本，然后对这15000多份样本进行平行比对，建立了一个用于系统性研究药靶扰动生物学的方法。

研究思路

研究团队首先通过RPPA技术平台，对15000余样本进行平行比对。其次与质谱、L1000 RNA表达谱等独立平台的数据相关联，进一步验证RPPA数据的可靠性。最后，在MCF-7细胞系聚焦分析和系统绘制了蛋白靶点-药物连接图，同时制作了一个交互式的、用户友好的数据门户，通过这个数据库，生物医学研究人员可以探索并直观的分析这些数据。

文章解读

Mills研究团队将RPPA的结果与质谱结果相对照，更好的验证了RPPA数据的可靠性。他们发现在两个蛋白质组学平台之间，相同细胞系间同一蛋白对的相关性明显高于随机蛋白对（图2）。

图2

同样作者又将RPPA数据与mRNA数据做对比，结果与质谱平台相似，两个平台的结果也具有高度一致性（图3）。

图3

接下来，研究团队挑选了RPPA数据最全的乳腺癌细胞株MCF-7进行分析，并覆盖了19种化药与组合，9种刺激以及不同的处理时间，处理样本共计1500个以上；涵盖了该细胞株主要的药物靶点，包括ER、PI3K/mTOR、AKT、MEK和EGFR等。通过对以往文章MCF-7细胞系的药物敏感性研究发现，MCF-7细胞对ER以及PI3K/mTOR这两个信号通路具有高度敏感性（图4A，B）。同时，对影响这两个信号通路的相关药物处理组的RPPA数据分析发现，又有其他的不同的信号通路受其抑制或激活（图4C，D）。

图4

作者对于两种药物拉帕替尼（HER1抑制剂）和GSK690693（Akt抑制剂）进行统计，得到了药物处理组的RPPA蛋白相关数据。结果显示利用蛋白改变量Δp值，能够筛选到更多潜在的生物标志物（图5A），并且相关性也会更好（图5B & 5D）；样本在药物处理后的不同时间点的数据表明，在药物处理的后期（大于8小时）预测水平明显好于初始阶段（小于4小时），因为当加入药物后细胞需要一些时间重建信号通路并适应治疗压力（图5C & 5E）。由此可见，RPPA技术非常适用于大规模样本的平行比对，通过处理组与对照组得出相应蛋白靶标的变化值，为高效筛选生物标志物提供了新的思路。

图5

最后，为了系统的评估抗癌药物的效用，研究团队基于RPPA数据建立了蛋白靶点-药物连接图（图6）。在这张图中，每个节点代表一个蛋白质或一种药物，是否连接是基于药物处理后相应靶点是否引起显著变化，药物-药物连接是基于两种药物是否引起相似的靶点变化。不同的药物处理组分别以不同的颜色加以区分，形成一套相连接并且相互区分的蛋白靶点-药物连接图。

图6

文章总结

RPPA技术对系统研究肿瘤细胞信号和药物作用机理有着无可比拟的优势，非常适用于大规模样本的平行比对，该文章的数据分析方法也值得借鉴。首先，RPPA的数据集为理解蛋白层面的因果关系提供了基础，基于这些数据，将有可能开发定量预测模型的信号网络。其次，研究发现虽然生物标志物在基线水平时有一定的信息含量，但当基线信号和反应信号相结合时，信息含量明显增加。再次，由于相关蛋白质变化情况反映了癌细胞如何关键的重新连接信号通路以生存和适应特定药物治疗的压力，为阐述抗药性机制和指导联合用药提供了理论依据。