10X Genomics单细胞转录组测序

10X Genomics应用的两个方向：1. 可以做一群细胞当中，每个单细胞的RNA表达情况的定量分析（查看每个细胞的mRNA表达特征，并根据其表达特征划分细胞群体）；2. 染色体的单倍体长片段的组装。这篇文章里只描述转录组测序。

10X Genomics的工作基于液滴捕获技术，相对而言可定制化比较强，通量可以无限制增加，操作方便简单。
通过液滴包裹单个磁珠和1个细胞，磁珠和细胞发生反应：细胞裂解后释放mRNA，磁珠上的引物尾巴可以做到与mRNA的特异性结合，从而实现捕获的目的。同时通过磁珠引物本身所带有的cell barcode序列和UMI序列，可以对不同细胞的不同转录本做标记区分。因为磁珠上的引物片段携带mRNA序列信息，在它的基础上通过反转录或复制的方式扩增，所有的转录信息便带上了cell barcode、UMI。

这篇文章里只讲10X Genomics的3'转录组测序和5'转录组测序。

1. 10X Genomics背景

首先看一下10X Genomics长什么样子吧？
它的功能就是制备油包水的乳浊液，配合微流控芯片一起工作。

10X Genomics

利用微流控技术分选单个细胞，然后将“1个bead”和“单个细胞”包裹在油滴中
一张芯片一次可以处理8个样本，每一列孔对应于一个样本

• Sample well 用来存放样本
• Gel Bead well 用来放 gel beads
• Oil well 用来放油
• Recovery well 是在做好乳浊液之后，回收乳浊液的孔

4排8列的微流控芯片

脑袋不容易想象？来看这张图：
beads在压力的作用下逐个通过管道，而细胞和酶在另一个垂直管道，尽可能将1个细胞打到1个bead上，然后混入油相。通过油滴包裹单个细胞和bead，形成油包水的结构，创造1个bead吸附1个细胞内的mRNA的微环境。

10X Genomics的工作原理

partitioning oil为油相
bead的体积比较大，被包裹的细胞比较小（图中可以看到的细胞还没有被裂解），而油相和bead之间充斥的液体中含有各种酶，其中就包括反转录酶（细胞裂解之后，bead通过polyT引物吸附游离的mRNA，然后直接在油包水的结构中进行反转录获得cDNA）。

油包水的结构示意图

2.1 3'转录组测序：

beads表面含有很多绒毛状的短序列引物，短序列包括4个部分：R1、10X barcode(一个bead只有一种，任意两个barcode序列之间至少存在2个碱基的差异)、UMI（UMI是一段随机序列，每一个DNA序列都有自己的UMI序列，经过PCR和深度测序得到的reads可以看出，哪些reads起始于一个原始cDNA分子，因此它的使用降低了PCR的偏好性）、polyT（真核生物mRNA 3'末端含有polyA尾巴，polyT用来与mRNA的3'末端互补配对）

10X Genomics的bead

以下4个步骤的讲解基于图片 “3'单细胞转录组测序文库构建过程”

1）cDNA反转录（RT）

通过polyT富集到beads上的mRNA，在酶的作用下反转录生成cDNA，同时在新合成链的5'端增加几个GC残基，在此基础上通过酶引入switch oligo（switch oligo是专门设计的引物用于cDNA扩增）

2）cDNA扩增

通过switch oligo做引物扩增

3）序列回收

通过以上两个步骤，便成功地将mRNA的序列信息引入到带有barcode和UMI的cDNA里，同时对它扩增。其中的barcode用来区分细胞a和细胞b...，UMI区分转录本1，转录本2...完成了对序列的特殊标记后，便可以序列回收，即使摆脱了油包水的结构，我们也可以通过“barcode序列”和“UMI序列”判断序列来源。

4）建库测序

将cDNA序列回收之后，便可以像普通的二代测序的步骤一样进行建库测序（片段化、引入接头等等），同时二代测序的建库过程中会添加index来区分不同的样本。
二代测序的建库步骤可以参考这个连接里
https://www.jianshu.com/p/1ccdaea9e822

3'单细胞转录组测序文库构建过程

实际应用过程中，转录本的定量由UMI的种类决定，而不仅仅是支持的reads个数，UMI解决了PCR偏好性的问题

UMI解决了PCR的偏好性

2.2 5’转录组测序：

上面解释过10X Genomics 3'转录组的测序，这种方式获得的测序序列其实都是3' polyA尾巴附近的mRNA序列。为啥呢？因为barcode和UMI在mRNA的3' polyA那一端（二代测序是短读长的测序方法，建库过程中对插入测序片段的长度有要求），mRNA长度太长时，其 5’端序列被打断，断裂的这部分序列便丧失了barcode和UMI的指引。

5'转录组测序所使用的捕获mRNA的beads与3'转录组测序不同，其polyA引物被换成了switch oligo，其目的就是将mRNA的5'端连接到barcode和UMI。

5'转录组测序beads 示意图

同样使用polyA来富集mRNA，以polyA为起点来做cDNA的反转录，同时在其5'末端加入C残基，这里的C残基会与beads上switch oligo的G残基互补配对。这样就将mRNA的5'末端连接到带有barcode 和 UMI的引物，同时以C残基为起点进行链的合成，最终获得带有barcode 和 UMI的cDNA链。后面的建库测序步骤便与3'转录组测序相同了。

10X Genomics 5'转录组单细胞测序建库原理

Post script: 除了以上的介绍，10X Genomics也可以通过改变beads上的引物类型，捕获标志性序列，以适应不同的研究和分析需求。
视频参考：https://mp.weixin.qq.com/s/o_qUf5VTKCZeRjjnE-cHMg