为探究早期人类胚胎骨骼干细胞起源，同济大学联合解放军总医院第五医学中心和北京放射医学研究所进行了相关研究，相应成果发表Cell Research杂志。该研究利用10x Genomics单细胞转录组测序绘制了早期人类胚胎肢芽、长骨和颅骨的发育图谱，并结合体内外功能验证发现了一群定位于软骨外膜，具有自我更新和分化为软骨与成骨细胞潜能的胚胎骨骼干祖细胞（eSSPC），对于深入理解人类骨骼发育及损伤修复机制具有重要意义。
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通过单细胞转录组和功能分析来剖析人类胚胎骨骼干细胞的个体发育
Dissecting human embryonicskeletal stem cell ontogeny by single-cell transcriptomic and functionalanalyses
【发表杂志】Cell Research（IF：25.617）；
【发表时间】2021年3月；
【应用技术】10x Genomics单细胞转录组测序；
研究流程
骨骼的发生发育在小鼠、小鸡和蝾螈等生物中已经得到了广泛的研究，而人类的研究主要停留在组织形态学水平。本研究首先对孕5周人类胚胎肢芽和孕8周人类胚胎长骨进行高通量单细胞转录组测序，分别分析肢芽和长骨的发育谱系，然后再结合流式细胞术等实验鉴定胚胎骨骼祖细胞（eSSPC）的表型标记（PDGFRAlow/-PDPN+CADM1+），最后在颅骨样本中发现了一群具有同样表型的细胞，说明其可能在膜内成骨和颅骨发育过程中发挥关键作用。
研究背景
先前的研究表明自我更新的骨骼干细胞（SSCs）存在于高等脊椎动物和早期发育阶段。SSCs是一群能够自我更新并分化产生软骨细胞、成骨细胞和基质细胞的组织特异性干细胞，在骨骼发育和损伤修复过程中发挥关键作用。人类胚胎SSCs在早期骨骼形成中的个体发生仍然是未知的。在脊椎动物中，附肢骨骼的最早祖细胞是在肢芽中形成的。虽然在小鼠和鸡肢芽中发现了不同的间充质祖细胞，但人类肢芽中的细胞异质性和谱系层次尚不清楚。
总之，关于人类胚胎骨骼发生的单细胞转录组测序研究仍然缺乏。在本研究中，通过10x Genomics单细胞转录组测序生成了第一个全面的人类胚胎骨骼发生细胞图谱。通过系统地检查多个骨骼部位的细胞异质性和谱系层次，本研究在人类胚胎长骨和颅骨中发现了不同的骨骼干/祖细胞。
主要结果
1. 整体分析肢芽和长骨发育过程中单细胞转录组
本研究对上肢和下肢芽（5个Weeks Post Conception，WPC），以及前肢和后肢长骨（8WPC）进行解剖并接受酶消化。流式分选后，进行10x Genomics单细胞转录组测序（图1b） ，最终在5WPC肢芽中获得19,890个单细胞，在8WPC长骨中获得15,680个单细胞。对肢芽和长骨样本的综合分析发现了16个亚群（图1c）。
PRRX1+肢芽间充质亚群和EPCAM+上皮细胞亚群主要存在孕5周样本。RUNX2+骨祖细胞、OSR2+NOV+软骨膜间充质基质细胞、SOX9+成软骨细胞和软骨细胞、MYOG+肌细胞以及SOX10+施旺细胞主要在孕8周样本中检测到。成骨软骨前体细胞（cluster4，OCP）平均分布于肢芽和长骨样本之间，提示最早的骨骼干祖细胞可能包含于其中（图1c-e）。
Pearson相关分析明确区分了成骨亚群和非成骨亚群。RNA velocity伪时间分析显示，肢芽间充质祖细胞向OCPs分化连续，随后细胞命运分化成成骨和软骨谱系（图1f）。PAGA分析显示，OCPs在连接肢体芽间充质祖细胞（PRRX1+）到胚胎长骨中的PMSC/软骨母细胞/软骨细胞（SOX9+）和骨祖细胞（RUNX2+）中发挥了关键作用（图1g）。
2. 肢芽发育过程中的间充质细胞谱系
在5WPC人类肢芽中识别出10个亚群（图2a）。4个间叶细胞亚群的层次聚类分析显示，LBM1（cluster 1）与LBM2（cluster2）聚类，而LBM3（cluster 3）和OCP（cluster4）聚类在一起（图2b）。在两个上皮细胞亚群中（图2a），只有cluster 9（对应上皮细胞1，图1c,d）高表达AER标志物FGF8，这与之前在小鼠胚胎中的研究一致。PAGA分析显示LBM2和上皮亚群之间存在很强的相关性（图2c）。细胞周期分析显示，LBM2相比其他间质亚群具有更强的增殖能力。GO分析显示，LBM2富含调控代谢过程的基因，而LBM3和OCP富含参与胚胎骨骼发育和骨化的基因。
本研究分析了最近发表的小鼠肢芽（E11.5）单细胞转录组测序数据集发现，除了LBM2和上皮（非AER亚群）亚群在小鼠肢芽中未被预测外，大多数人类亚群在小鼠中是保守的。缺乏高度增殖的LBM2亚群暗示E11.5小鼠肢芽提前成熟。小鼠OCP亚群高表达SOX9，提示早期软骨分化。综上所述，与人类相比，这些数据揭示了人体肢芽间充质和上皮细胞的细胞异质性和物种特异性。
3. 长骨发育过程中的软骨谱系
由于5WPC人肢芽未开始成骨，本研究继续分析8WPC长骨，以寻找人类胚胎SSCs。骨软骨细胞系（OCLCs）分为7个亚群（图3a）。胚胎长骨OCP细胞进一步分群鉴定得到3群干祖细胞，GO分析显示，与干细胞增殖相关的基因在cluster3中富集（图3b），提示其可能含有胚胎骨骼干细胞/祖细胞（eSSPC）。拟时序分析显示从eSSPC到骨祖细胞、成软骨细胞/软骨细胞和软骨膜间充质基质细胞（PMSC）亚群的强定向流（图3c）。转录调控网络分析发现eSSPC富集了转录因子FOXP1/2（图3f）。免疫荧光染色显示FOXP1/2+细胞主要定位于软骨外膜和新生的初级骨化中心内部。连续性克隆传代以及体内外分化实验证明eSSPC具有自我更新和成骨、成软骨分化潜能，它有可能调节长骨发育和初级骨化中心（POC）的形成。
4. CADM1作为胚胎骨骼祖干细胞（eSSPC）表型标记的鉴定
为了分离eSSPC用于体外功能研究，研究者首先筛选长骨软骨细胞系OCLC亚群间差异表达的细胞表面标记物。发现细胞粘附分子CADM1在eSSPC中优先表达（图4a）。CADM1也在施旺细胞中表达，免疫荧光显示CADM1分布于软骨膜和初级骨化中心（POC）（图4b）。在转录平均细胞评分（TACS）分析中显示，在软骨细胞OCLC亚群中富集PDGFRAlow/-PDPN+CADM1+细胞可进一步提高eSSPC的纯度。用流式细胞仪对eSSPC进行单细胞转录组测序分析排序PDGFRAlow/-PDPN+CADM1+细胞。聚类分析发现两个不同的亚群，包括93.3%的eSSPC表达FOXP1、FOXP2和GAS2, 6.7%和施旺细胞表达SOX2、SOX10和MPZ。相似度分析也证实eSSPC是PDGFRAlow/-PDPN+CADM1+高度富集细胞。
研究者进一步检测eSSPCs的自我更新和分化潜能，发现PDGFRAlow/-PDPN+CADM1+细胞可以分化为成骨和软骨。PDGFRAlow/-PDPN+CADM1-细胞仅发生成骨分化。
5. 颅骨发育过程中的成骨谱系发展
为了测试在胚胎颅骨中是否存在类似的骨骼干细胞，研究者在2个8WPC人颅骨中进行了单细胞转录组测序分析，发现了一群同样具有PDGFRAlow/-PDPNCADM1+表型的神经脊来源细胞（Neural crestderived cells, NCDCs）在颅缝和软骨膜内富集，暗示其可能在膜内成骨和颅骨发育过程中发挥关键作用。
研究结论
人类骨骼干细胞（SSCs）已经在胎儿和成人的长骨中被发现。然而，人类胚胎SSCs在早期骨骼发生过程中的时空个体发生尚不清楚。在这里，本研究以单细胞分辨率绘制了人类肢体芽和胚胎长骨的转录景观，以解决这个基本问题。本研究发现在人肢芽间叶和上皮内存在显著的异质性，并利用已知的标记基因将它们沿着近端远端和前后轴排列。骨-软骨形成的祖细胞最早出现在核心肢芽间充质中，在胚胎长骨进行软骨内成骨过程中，这些祖细胞产生了多个群体的干细胞/祖细胞。重要的是，本研究发现了一个软骨膜胚胎骨骼干/祖细胞（eSSPC）亚群，它可以自我更新并生成骨软骨细胞系，但不能生成脂肪细胞或造血间质。eSSPC以粘附分子CADM1为标记，与FOXP1/2转录网络高度富集。有趣的是，在人类胚胎颅骨的矢状缝中也发现了具有相似表型标记和转录网络的神经嵴衍生细胞。综上所述，本研究揭示了人类胚胎骨骼发生过程中的细胞异质性和谱系层次，并识别出独特的骨骼干/祖细胞，它们协调软骨内和膜内骨化。
参考文献
He J,Yan J, Wang J, et al. Dissecting human embryonic skeletal stem cell ontogeny bysingle-cell transcriptomic and functional analyses.Cell Res. 2021; 31(7): 742-757.
李超 | 文案