Label-free classification of cultured cells through diffraction imaging

通过衍射成像对培养细胞进行无标记分类

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  在流式细胞仪设置中非常需要根据其3D形态自动分类生物细胞。 我们使用衍射成像方法在实验和数值上研究了这种可能性。 已经开发了基于灰度共生矩阵（GLCM）算法的快速图像分析软件，以从测量的衍射图像中提取特征参数。 GLCM分析和随后的分类结果证明了六种培养细胞之间快速分类的潜力。 结合数值结果，我们表明衍射成像流式细胞仪的方法具有作为生物细胞的高通量和无标记分类的平台的能力。

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  功能与生物细胞的结构相关。对细胞形状和结构的研究，在此定义为3D形态学，可以提供对各种细胞活动（如细胞繁殖和分化）的许多生化过程的见解[1,2]。因此，形态学特征为临床诊断和细胞研究提供了强大且通常是关键的标记。在几乎所有情况下，细胞的形态学研究依赖于传统的显微镜方法，并且由于细胞形态的多样性和复杂性，通常需要手动分析图像数据。从这个角度来看，人们会对基于3D形态学的大细胞群的自动化和实时分析的流式细胞术方法感兴趣。然而，大多数现有的流式细胞仪都是基于这一概念设计的，用于检测散射光和荧光的角度积分信号，以便快速和自动化细胞分类[3]。该方法产生非常有限的形态学信息，并且主要依赖来自染色细胞的荧光信号作为分析和分类的分子标记。即使使用流式细胞仪探测细胞形态的非衍射成像，自动分析图像数据以进行快速细胞分类仍然是一个挑战[4]。与上述方法不同，已经开发了扫描流式细胞术的方法以获得极角分辨的光散射信号，以利用细胞的涂覆球模型得到细胞内折射率分布[5,6]。

  弹性光散射（或此处使用的光散射）是折射率的不均匀性的结果。当高度相干的光束激发细胞时，可以使用成像检测器将弹性散射光的空间分布记录为衍射图像。通过对单细胞光散射的建模研究，已经表明散射光强度的空间分布与生物细胞的三维形态相关，呈细胞内折射率分布[7-12]。这些结果促使我们开发了一种流式细胞仪方法作为无标记平台，用于快速采集由流体动力学聚焦流过激光束的单个细胞的高对比度衍射图像[13,14]。尽管用微球验证，但这种新的流式细胞术方法是否具有实时快速细胞分析和分类的能力仍然未知。我们在这里报告图像分析的初始结果和测量的衍射图像的分类，以回答这个关键问题。还将这些结果与使用具有核的细胞模型进行的数值模拟进行比较，以仅研究衍射图像纹理对细胞形态，折射率和取向的依赖性。

  本报告中提供的测量衍射图像是通过使用衍射成像流式细胞仪记录由入射光束照射的单个细胞散射的光的远场分布而获得的[13,14]。使用六种类型的培养细胞用流式细胞仪获取图像数据或者获得用于重建其3D形态的共焦图像用于模拟。在这些细胞中，三种（Jurkat细胞，NALM-6细胞和U937细胞）来自上皮癌细胞的恶性白细胞（WBC）和三种（MCF-7细胞，B16F10细胞和TRAMP-C1细胞）。将细胞在37℃，5％CO 2气氛下在标准培养基中孵育，在指数生长期移除，并在细胞实验室中在冰上离心管中作为细胞悬浮液运输至激光实验室，浓度为约106细胞/ mL 。使用单独的细胞样本，我们还对所有六种细胞类型进行共聚焦成像，以用单或双荧光染色研究它们的3D形态。为了模拟衍射图像，从来自白血病前B细胞的所选NALM-6细胞的共聚焦图像获得三种细胞模型。我们染色这些细胞的细胞核仅用于数值研究细胞取向，3D形态，核指数和体积对衍射图像的影响。

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图1.使用由C（θ0，0）给出的方向导入的3D细胞形态和通过投影元素S11（θs，）的衍射图像，根据Mueller矩阵元素在波长λ处的光散射的FDTD模拟的配置 s）以负x轴为中心的传感器平面。

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  为了测量细胞的衍射图像，我们在我们的衍射成像流式细胞仪中采用流动室的“喷射流”设计，将核心和鞘液的层流浸入充满水的玻璃比色杯中。此设计特征是获得用于分析和特征提取的高对比度衍射图像的关键。成像配置类似于图1中所示的配置，除了成像单元放置在流动室和CCD相机之间。 cw固态激光器在光束扩展后提供直径为15mm且波长为532nm的非偏振入射光束，功率高达48mW，然后在流动室中的核心流体处聚焦成直径约25μm的点。使用无限远校正的长工作距离物镜，然后使用分束器和管透镜，在距离约25°的半锥角的入射光方向成90°的角度区域中收集散射光。采用16位CCD相机，每个流动池获取一个衍射图像，曝光时间为1ms，另一个相机用于实时监测。由于相对长的曝光时间，有意地将电池的流速设定为约2至5mm / s的非常小的值以减少模糊。流动室设计，成像单元和校准程序的其他细节可以在早期的出版物中找到[13,14]。

  我们对衍射图像进行了数值模拟，以深入了解三维形态与条纹图案和纹理参数之间的相关性。使用并行有限差分时域（FDTD）代码[9]来模拟使用从NALM-6细胞的共聚焦图像重建的细胞模型的光散射。首先用结合DNA分子的荧光染料（Syto-61，Invitrogen）染色NALM-6细胞，然后用共聚焦显微镜（LSM 510，Zeiss）成像。所选细胞的三维结构是通过内部开发的软件从共聚焦图像堆栈获得的，只有细胞核[11]。在将折射率分配给宿主培养基（nh），细胞质（nc）和细胞核（nn）后，将细胞模型导入FDTD代码以计算Mueller矩阵Sij（（θs，s）i，j = 1 ，2,3,4，其中θs为散射极角，s为方位角[10]。元素S11（θs，s）投影到截取x轴的平面上，如图1所示作为侧向散射在约30°的半锥角内的模拟衍射图像。在将S11元件投射到位于rp =（ - x0，y，z）的像素时，距离| rp |对投影平面的影响和考虑rp的入射角。因此可以将非偏振光散射的像素强度I写为

Measured diffraction and confocal images of 6 cell types

  使用衍射成像流式细胞仪系统，我们获得了偏离入射光方向90°的非偏振侧向散射，作为来自6种培养细胞的衍射图像。在测量时，从一个细胞生物学实验室接收的悬浮细胞被注入核心流体贮存器并由核心流携带通过入射激光束用于衍射成像。所有测量均在约22℃的室温下进行，并在离开细胞或从培养箱中取出后6小时内完成。对于每种细胞类型，我们从多达70个流动细胞获得单细胞衍射图像，测量时间为1小时，以维持细胞活力。将50倍显微镜物镜沿着x轴朝向流动室放置在200μm的离焦位置（参见图1）。测量的衍射图像由1600x1200像素和16位像素强度组成，以适应散射光信号的大动态范围。

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图2.在λ= 532nm处获得的单个流动细胞的测量衍射图像（1）和增强GLCM图像（2）的典型对：（a1 / a2）Jurkat; （b1 / b2）NALM-6; （c1 / c2）U937; （d1 / d2）MCF-7; （e1 / e2）B16F10; （f1 / f2）TRAMP-C1。 GLCM图像分别位于衍射图像的右侧。 左边的比例尺表示转换为8比特像素值后的归一化衍射图像的像素值，右边的比例条表示GLCM元素的值，pmax =（a2）0.0172; （b2）0.0204; （c2）0.0160; （d2）0.00302; （e2）0.00175; （f2）0.00297。

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  开发了一种图像处理软件，用于每个进口衍射图像的GLCM分析，并从GLCM或图像中提取特征参数作为输出。对于6种细胞类型，衍射和增强的GLCM图像对的实例显示在图2中。增强的GLCM图像是从GLCM获得的，使用每个像素的3x3窗口平均值来改善可见性，中心像素的权重为1，窗口中的其他像素为0.5，然后是像素归一化。通过视觉检查可以立即看出，源自恶性WBC（Jurkat T细胞，NALM-6 pre-B细胞和U937单核细胞）的细胞与源自上皮癌细胞的细胞之间的条纹图案或图像纹理存在显着差异（ MCF-7乳腺癌细胞，B16F10黑素瘤细胞和TRAMP-C1前列腺癌细胞）。进一步观察到这种区别在所有测量的衍射图像中保持相当一致。为了定量研究这些差异以进行自动分类，我们从测量数据中随机选择30到40个衍射图像作为训练集。

  其余的测量衍射图像用作基于GLCM参数的自动分类研究的测试集。将GLCM分析应用于训练集，以获得[16]中定义的每个图像的12个统计参数，并且选择5作为自动分类的分类器。使用支持向量机（SVM）算法[18]开发的另一种软件用于在测试集中对具有衍射图像的细胞进行分类。表1列出了来自训练集的衍射图像的5个GLCM参数的平均值和标准偏差，表2显示了来自测试集的衍射图像的细胞分类结果。

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图3.从具有用于细胞核和线粒体的双荧光染色的细胞获得的典型共聚焦图像切片：（a）Jurkat; （b）NALM-6; （c）U937; （d）MCF-7; （e）B16F10; （f）TRAMP-C1。 棒=5μm。

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图4.具有3个重建的NALM-6细胞模型的模拟衍射图像：从（a）到（d）的顶行：细胞＃1; 从（e）到（h）的中间行：单元＃8; 从（i）到（l）的底行：单元格＃9。 所有细胞具有相同的折射率，对于宿主培养基，nh = 1.33，对于细胞质，nc = 1.368。 （a），（e）和（i）的列是针对细胞核的沿z轴或C（θ0= 0，0= 0）和nc = 1.45的取向的细胞; （b），（f）和（j）的列是C的单元（θ0= 109°，0= 118°），nc = 1.45; （c），（g）和（k）的列用于C（θ0= 0，0= 0）和nc = 1.50的单元; （d），（h）和（l）的列用于C（θ0= 0，0= 0）和nc = 1.50的单元，其中单元和核体积按比例减少到一半。 最左边的列显示了从上到下的＃1，＃8和＃9细胞模型的投影图像，两个数字分别表示以μm3计的总细胞体积和细胞核与细胞的体积比。

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  为了分析衍射图像和细胞形态之间的相关性，我们在图3中呈现了从相同细胞实验室取得的双染细胞的荧光图像。对于这些图像，我们在共聚焦成像之前用Syto-61和Mito-Tracker Orange的两种荧光染料染色细胞，主要分别与细胞核和线粒体结合。细胞核和线粒体作为靶向细胞内细胞器的选择是基于之前对它们对光散射的影响的研究[8,11,12]。图3中所示的图像切片是靠近细胞成像堆叠中心的图像切片，因此代表每种类型中细胞的典型尺寸。即使3D形态在每种类型的成像细胞之间变化，也可以清楚地识别某些特征以区分细胞类型和共焦图像堆栈。例如，上皮癌细胞的线性大小通常比来自恶性WBC的线性大小大40％至60％，具有相似更大的核和线粒体数量。

  我们应用GLCM算法从流式细胞仪采集的6种培养细胞类型的衍射图像中自动提取特征。 测量数据清楚地表明衍射成像流式细胞术的方法具有快速和无标记细胞分类的能力。 实验结果与共焦成像和模拟结果的进一步比较表明，以入射光方向为中心90°的侧向散射获得的衍射图像主要取决于对细胞尺寸具有非常小的敏感性的细胞的3D形态。 该平台技术的分类能力可以通过增加流动稳定性进一步改善，并通过结合更宽范围的角度或多个角度范围而得到增强。