文献阅读--活体成像技术助力植物生殖过程的理解

       本次阅读的文章是14年发表在《current biology》上的《Live-Cell Imaging Reveals the Dynamics of Two Sperm Cells during Double Fertilization in Arabidopsis thaliana》。

        活体成像技术主要采用生物发光（bioluminescence）与荧光（fluorescence）两种技术。生物发光是用荧光素酶基因标记细胞或DNA，而荧光技术则采用荧光报告基团（GFP、RFP, Cyt等）进行标记。利用一套非常灵敏的光学检测仪器，让研究人员能够直接监控活体生物体内的细胞活动和基因行为。通过这个系统，可以观测活体动物体内肿瘤的生长及转移、感染性疾病发展过程、特定基因的表达等生物学过程。

科学问题：受精的过程是怎么样的，两个精细胞与卵细胞和中央细胞的结合有偏好性吗？

实验材料： The pHTR10:HTR10-mRFP（标记精细胞核）, pACT11:H2B-GFP （标记雌方的核，如助细胞）

pLAT52:GFP（标记花粉管）        pDD45:mtKaede  （标记卵细胞膜）   pFWA:FWA:GFP （标记中央细胞核）

 pACT11:MSI-GFP （花粉管细胞质） gcs1(hap2)/+ 

实验结果：

利用ICCD相机，发现精细胞的释放是一个很快的时间，可能不足1s。下图可以看出。0.2s时精细胞已经超过营养细胞，3.2s已经穿透雌配子体组织，9.6s时已经在退化助细胞边缘。

在精细胞释放前，速度0.086 μm/s,释放后达到10 μm/s，几乎快了100倍。但从释放后快速运动的时间平均8.8s。

Sequential Imaging of Male Gametic Nuclei after Pollen TubeDischarge

                                                  pHTR10:HTR10:mRFP.   pACT11:MSI1:GFP

然后发现在到达退化助细胞边缘后，精细胞会停下来平均7.4min时间。

Time-Lapse Imaging of the Entire Double-Fertilization Processbiany

                                    pHTR10:HTR10:mRFP        pACT11:H2B:GFP         pLAT52:GFP

下面想看融合过程，用了hap2的材料,比较野生型和突变体区别。在10min时野生型已经能正常受精，但是gcs突变体15min还不行。

Movement of sperm cell nuclei of wt and gcs1/+

通过精卵融合以及精细胞与中央细胞融合的事件时间大体相当，仔细计算下来的两次融合之间存在2.5min间隙，作者认为这个短短的间隙给防止多精融合一机会。

受精计时

最后作者想看一看两个精细胞的融合有无卵细胞结合偏好性。于是精细胞用了一个可光转换的荧光蛋白标记（a monomeric Kikume Green-Red (mKikGR) 和HTR10标记。通过紫外照射将光谱由绿色变成红色。由于在花粉管中精细胞有先后之分。通过照前面和后面发生荧光变化，发现两个精细胞的前后位置对最后受精对象没有明显偏好。

Photoconversion Analysis of the TwoAligned Sperm Cell Targets

result

最后用一个模型归纳一下。

model

1.缓速前进。

2.精细胞释放后在助细胞中快速前进。

3.停留7.4min。

4.无偏好性几乎同时融合。