张泽民老师2021年2月份发表在cell上的文章
Tumor-infiltrating myeloid cells (TIMs) 是肿瘤进展的关键调解者，但是它们在不同肿瘤间的相似性和异质性等关键特性仍然未知。该研究对15个癌种，210个病人的髓系细胞进行了pan-cancer分析，鉴定出了跨癌种间TIMs的相似度，并探究了不同肿瘤类型中髓系细胞亚群的特异性组成和特征。有助于我们理解肿瘤微环境的复杂性和指导不同肿瘤类型的免疫治疗。
Highlights
- Pan-cancer analysis reveals heterogeneity in tumor- infiltrating myeloid cell composition
- The ratio of TNF+ versus VEGFA+ mast cells underlines their cancer-type-specific functions
- LAMP3+ cDCs are widely present, with diverse developmental origins and functions
- Pro-angiogenic TAMs exhibit distinct expression profiles across different cancer types
1. Landscapes of myeloid cells in 15 cancer types revealed by scRNA-seq analysis
Fig 1A：为了得到TIMs的deep transcriptional atlas，作者对15个癌肿的210个病人的380个组织 (自己测了一部分，也整合了此前发表的样品) 进行了分析，得到了138161个髓系细胞。
Fig 1B：每个癌肿的病人数
Supplemental Fig 1A：每个癌肿的细胞数和样品来源
Supplemental Fig 1B：每个癌肿的细胞的组织来源占比（肿瘤/非肿瘤/外周血/淋巴结），大部分都是肿瘤组织细胞
Supplemental Fig 1C：为了定义髓系细胞的亚群，最小化批次效应，作者单独对15个癌肿的髓系细胞进行了非监督聚类，并定义出了四种主要髓系细胞群（肥大细胞，pDCs，cDCs和单核/巨噬细胞），cDCs和单核/巨噬细胞又被分为了更精细的亚群。
Fig 1C D：以鼻咽癌 (ESCA) 细胞为例的四大类髓系细胞分群和marker基因表达
Fig 1E：ESCA各个细胞亚群的marker基因气泡图，cDCs又被细分为3个亚群，单核巨噬细胞又细分为6个亚群（如下）。
Canonical Marker基因：(参考Fig 1E)
肥大细胞：KIT,TPSAB1
pDCs：LILRA4
cDCs：HLA/FCER1A
单核/巨噬细胞：CD68/CD163
亚群Marker基因：
两群经典的cDCs：CLEC9A+ cDC1s和CD1C+ cDC2s
新近鉴定出的cDC：LAMP3+ cDC
单核细胞：CD14hiCD16-经典单核和CD14+CD16high非经典单核
四群巨噬细胞：根据高表达marker自己定义的
其他癌肿的细胞分群也是根据这些marker，得到的细胞群也类似。CRC和黑色素瘤中还鉴定出了CD14hiCD16+的intermediate单核细胞，可能是因为这两个癌肿样品中有比较多的血液样品。
Fig 1F：与cDCs和单核细胞在每个癌肿中都存在不同，巨噬细胞亚群在不同的癌肿中展示出较大的异质性（结合Supplemental Fig 1C也可以看出来）。比如作者鉴定出了肺癌特异性的巨噬细胞群Macro_PPARG，这一群细胞代表着肺脏肺泡组织原位巨噬细胞，特征性高表达PPARG, MARCO, MRC1, and MSR1
Fig 1G：使用四个癌肿 (LUNG, KIDNEY, PAAD and STAD)的细胞的两个独立的研究数据作比较，进一步验证了细胞群鉴定的合理性(Supplemental Fig 2)。因为这四个癌肿的数据都是来自两个独立研究，作者首先对每个独立研究的数据进行了单独降维聚类，随后使用Scanorama进行了整合。被注释为相同细胞群的细胞会被整合在一起。随后作者训练了一个logistical regression model去定量了不同研究中细胞群的相似性，结果显示不同数据集中这些细胞的一致性较好。
降维和聚类用的
Scanpy的workflow
不同数据的整合用的Scanorama评估不同数据集中数据一致性的模型做法：
2. Mast cells exhibited diverse functional potentiality in different cancer types
作者随后比较了不同癌肿类型中浸润的髓系细胞的主要细胞群之间的关系
Supplemental Fig 3A：作者先对15个癌肿的髓系细胞进行了整合，发现不同癌肿的同一类细胞可以比较好的整合在一起。
Fig 2A, Supplemental Fig 3B：为了比较细胞群间的相似性，作者计算了不同癌肿类型的主要细胞群间（15个癌肿*4个主要细胞群）的相似度，同一类细胞被聚在一起。
Fig 2B：作者比较了四类主要细胞群在不同癌肿间的比例，单核巨噬细胞占了最大的比例，占到绝大多数细胞群的TIMs的50%以上。pDCs则比较少，在TIMs中小于10%。cDCs的在不同癌肿间的占比则比较稳定（10%– 20%）。肥大细胞在不同癌肿间的占比异质性较大。比如在UCEC (uterine corpus endometrial carcinoma)和HCC中肥大细胞几乎缺如，但是它在NPC (nasopharyngeal cancer)中占比较多，提示肥大细胞在不同肿瘤中可能具有不同的功能。
Supplemental Fig 3C：前面都是比的所有来源sample中细胞的比例，这里看了一下肥大细胞在不同来源样品中的占比，绝大多数肿瘤样品中(T)的肥大细胞都比正常组织(N)要高，提示它们可能参与肿瘤发生和进展。
Supplemental Fig 3D E：但是在UCEC中，肥大细胞的数量在癌旁组织中增多(D)，Ro/e分析也验证了这种结论。这个现象可能与生殖现象有关。
Fig 2C：有趣的是，UCEC的肿瘤组织的肥大细胞和正常组织相比的TNF是下调的。肥大细胞来源的TNF被报道在DC的功能和T细胞priming中起到重要作用，起到抗肿瘤作用1。
Supplemental Fig 3F：随后作者在所有癌肿的细胞中查看了TNF的表达模式，发现多种癌肿中的tumor-derived mast cells存在TNF的低表达，提示存在inhibitory program阻碍着这些肿瘤的肥大细胞的抗癌活性。
Supplemental Fig 3G：此外，作者还发现到肺癌病人在residual disease (RD) state的时候，和酪氨酸酶抑制剂治疗前或者进展期相比TNF+肥大细胞更多，进一步支持了TNF+肥大细胞在抗肿瘤免疫中的作用。
肿瘤中的肥大细胞在肿瘤细胞命运决定中起着双重作用2。除了TNF，mast-derived VEGFA是肿瘤血管生成的关键基因3。这提示着进一步探究肿瘤中肥大细胞异质性的必要性。
Supplemental Fig 3H：使用ROGUE分析，我们观察到肥大细胞在4个主要细胞群中展示出很高的异质性。
Supplemental Fig 3I：直接比较了不同肿瘤中肥大细胞TNF和VEGFA的表达，观查到一些肿瘤中是mutually exclusive表达的而一些肿瘤中是co-expression的，提示不同肿瘤中的肥大细胞对肿瘤细胞具有不同的复合效果。
Fig 2D：IHC染色在THCA中确认了两种肥大细胞亚群的存在 (TPSAB1和TNF/VEGFA共染)
Fig 2E：为了比较不同肿瘤组织中肥大细胞对肿瘤细胞的作用，作者首先定量了TNF+/VEGFA+肥大细胞的比值，观测到绝大多数肿瘤中VEGFA+肥大细胞的比例都远高于TNF+肥大细胞，提示这些组织中肥大细胞整体上是促血管生成的。其中NPC是唯一的TNF+肥大细胞比例更高的细胞(ratio=2.4)，提示这种肿瘤中肥大细胞的主要作用是抗肿瘤的。
Fig 2F Supplemental Fig 3J：TCGA中NPC的数据也证明，更高的肥大细胞marker的表达与NPC患者更好的预后相关，在其他肿瘤中则相反，与E图结论一致。
这些结果提示肥大细胞在NPC中起到抗肿瘤作用，在其他肿瘤中则起到促血管生成的促进肿瘤进展的作用。
为了进一步探究TNF+肥大细胞在NPC中富集的潜在机制，作者比较了TNF+和TNF-肥大细胞，使用在TNF+肥大细胞中高表达的基因做了NicheNet分析。
Fig 2G：互作结果显示TAMs高表达的SPP1和IL-1b可能是驱动TNF+肥大细胞的功能性配体
Supplemental Fig 3K：CellPhoneDB的结果也同样提示NPC中肥大细胞主要与巨噬细胞发生互作
Fig 2H：而且IL1B-ADRB2是最主要互作受体配体对之一。既往报道中ADRB2在抑制肥大细胞促炎介质的释放中起到重要作用。
Fig 2I：此外，作者发现，肿瘤组织中IL1B+巨噬细胞和TNF+肥大细胞的比例存在相关性。
Fig 2J：NPC中的IL1B+巨噬细胞比例高于其他肿瘤组织
小结：这些结果提示NPC中的IL1B+ macrophages可能驱动肥大细胞的抗肿瘤特性。
3. Distinct developmental origins of the widely present LAMP3+ cDCs
随后作者分析了cDCs的异质性和功能
Fig 3A B：为了评估不同肿瘤组织中三个cDC亚群的相似性，作者做了聚类发现不同组织的cDC细胞比较好的聚在一起，提示肿瘤类型对cDC细胞的转录影响较小 (A)。marker基因的热图也提示不同癌肿中的cDC具有相似的marker基因表达 (B)。其中LAMP3+cDCs是是张泽民老师此前在HCC中报道过的一个特异性亚群4，这两张图的结果也提示这个细胞群在多种癌肿中广泛存在。
Fig 3C：免疫荧光结果也验证了这个细胞群的存在，而且这类细胞在位置上常常与多种T细胞相邻。
Fig 3D：不同肿瘤中LAMP3+cDCs占cDCs的比例有较大差别
Fig 3E：多种肿瘤样品中的LAMP3+cDCs比例都比癌旁组织中要高很多。但也有一些肿瘤组织比如THCA中LAMP3+cDCs在癌旁组织中比癌组织要多(Supplemental Fig 4G)，提示癌组织和癌旁组织组织中LAMP3+cDCs具有不同功能。
Fig 3F：因此作者比较了癌组织和正常组织LAMP3+cDCs的转录差异，发现在癌组织LAMP3+cDCs的上调基因中之一是CMTM6，一个PD-L1蛋白调节分子，通过降低PD-L1泛素化和增加PD-L1蛋白半衰期起作用。在张老师19年的cell4中就报道过LAMP3+cDCs细胞可以通过PD-1/PD-L1与多种T细胞互作，因此作者想要进一步探究LAMP3+cDCs中PD-L1和它的regulators的表达
Fig 3G：结果显示不同肿瘤的LAMP3+cDCs中PD-L1的表达都出现增高，但是它的regulators，包括AXL, TRL3, CD40的表达则存在异质性。
这些结果提示，尽管LAMP3+cDCs中PD-L1的表达调控机制复杂且由不同的regulators调节，但是在不同癌肿中它的高表达是普遍存在的。PD-L1的抗体效能与肿瘤组织中LAMP3+cDCs的PD-L1表达是否有关仍然未知。
近期有研究显示LAMP3+ cDCs可能从cDC1s和cDC2s分化而来4（还是张老师19年那篇cell）。
Fig 4A, B, Supplemental Fig 5 A-C：使用Monocle, CytoTRACE, direct stratification of LAMP3+ cDCs和SingleR证实了不同肿瘤中LAMP3+ cDCs都是由cDC1s和cDC2s分化来的结论。
Fig 4C, Supplemental Fig 5D：尽管肿瘤组织中cDC2的比例比cDC1高，但是各个癌肿中cDC1 derived LAMP3+ DCs显著更多，除了PAAD和NPC。
Supplemental Fig 5F：前面的结论在另一个独立的PAAD数据集中也得到了验证
随后作者比较了不同来源的LAMP3+ DCs的转录差异
Fig 4D, Supplemental Fig 5F：和此前的研究一致，IL12B (可以诱导Th1细胞分化)由cDC1 derived LAMP3+ DCs特异性表达。cDC1 derived LAMP3+ DCs还高表达BTLA(可以引起Treg分化，引起免疫耐受)，和此前的报道中mregDCs可以驱动幼稚T细胞分化成Treg细胞相一致。cDC2 derived LAMP3+ DCs则高表达cDC2的marker基因CD1E并且高表达CCL17 (招募CCR4^+% Treg进入肿瘤组织，生成免疫抑制微环境。)
Fig 4E： 使用SCENIC计算了转录调控网络，得到了两种不同来源LAMP3+ DCs的regulons，包括已知的DC相关的转录因子RARA和ZEB1。
这些结果提示尽管cDC1和cDC2都分化成LAMP3+ DCs，但不同来源的LAMP3+ DCs仍然存在不同的转录特性和功能差异。
作者随后探究了驱动cDCs成熟的细胞外基质，并将它们分为3种不同的gene signature：cDC1-specific, cDC2-specific 和 shared maturation signatures (Table S4)
Supplemental Fig 5G：共有的成熟signature可以活化cDC1和cDC2共有的成熟和活化过程。比如IL-21被报道可以调控DC的功能，增强NKT细胞产生IFN-r。
Fig 4F：cDC1和cDC2特有的signature。与此前研究一致，IL-4和IL12B调节cDC1s的成熟，而IL-15调控cDC2s的成熟。此外结果显示，多种IFNs也出现在cDC2s成熟的signature中，提示它们可能在cDC2s的成熟中起到重要作用。
5. Variation of cDC2 sub-populations across tumors
作者随后使用他们新测的包含8个癌肿样本的scRNAseq的数据去探究cDC2s的异质性（为什么？）
Fig 5A：四类DCs的ROGUE分析提示cDC2s具有最高的异质性（？这个图难道不是最低）
Fig 5B-D, Supplemental Fig 6A：对cDC2s重新做了降维和分群，得到6个亚群，每个亚群都有它们的特征性基因。
Fig 5E, Supplemental Fig 6B：用SCENIC做了不同亚群的转录因子调控网络，鉴定出了各个亚群特异的转录因子。
Fig 5F, Supplemental Fig 6C：随后作者探究了不同cDC2亚群和LAMP3+ DCs的关系，分析了哪个cDC2亚群更有可能分化为LAMP3+ DCs。结果提示C06_cDC2_CXCL9亚群是LAMP3+ DCs的主要来源（怎么做的？）
Supplemental Fig 6D-E：和其他cDC2群相比，C06_cDC2_CXCL9亚群高表达CXCL9和IDO1，这两个基因分别参与调节免疫活化和诱导免疫抑制。
Fig 5G：有趣的是，在C06_cDC2_CXCL9向LAMP3+ DCs分化的过程中，CXCL9的表达逐渐下降而IDO1的表达逐渐上升，提示CXCL9+ cDC2s在分化成LAMP3+ DCs过程中获得了增强的免疫抑制功能。
Supplemental Fig 6F：作者随后比较了肿瘤中cDC2s亚群的组成
Fig 5H, Supplemental Fig 6G：cDC2s亚群组成提示两种促炎的cDC2亚群 (FCN1+和IL1B+) 在不同肿瘤中存在明显差异。
这些结果提示这些cDC2亚群可能参与不同的肿瘤免疫反应。因此当给予针对这些促炎性cDC2亚群的治疗时，不同的肿瘤类型可能会有不同的反应。
6. Macrophage subsets exhibit distinct transcriptomic patterns among various tumor types
Fig 6A, Supplemental Fig 7A：为了比较不同单核巨噬亚群间的关系，作者对它们做了聚类。发现不同癌肿间的CD14+和CD16+都分别聚在了一起。提示这两种细胞受局部组织环境影响较小。
Supplemental Fig 7B：血液和组织的两种单核细胞的基因表达热图。尽管所有的单核都表示经典单核相关基因CD14, CD16和FCN1，blood-derived单核显示出更高的中性粒细胞相关基因的表达，比如S100A8, S100A9和CSF3R而癌旁组织起源的单核则高表达HLA基因(HLA-DQA1和HLA-DQB1)以及巨噬细胞相关基因(CD163和CD68)，提示单核细胞存在浸润进组织并分化成巨噬细胞的中间状态。此外，肿瘤浸润单核细胞高表达炎症因子(IL1B, CCL4, CXCL2和CXCR4)，细胞生长调节子(AREG和EGR1)，组织原位marker(NR4A1, NR4A2, NLRP3)和NFkB信号基因(NFKB1和NFKBIA)
与单核的结果相对，不同癌肿中不同的巨噬细胞亚群则具有差异性(Figures 1F and S1C)，而且不同组织的巨噬细胞亚群也无法很好的聚在一起(Fig 6A)，提示巨噬细胞亚群构成较复杂，而且可能与局部组织微环境对巨噬细胞的作用有关。
Supplemental Fig 7C D：作者通过entropy-based metric来定量数据的混合程度和Scanorama整合进一步证实了上面的结论。
Supplemental Fig 7E：通过查看marker基因SPP1和C1QC(highlighted by our recent publication5)，作者发现在CRC和BRCA中，SPP1和C1QC存在mutually exclusive的表达，但这两个基因在UCEC中共表达。
因此，不同癌肿组织中的巨噬细胞异质性较大，为了更好的研究他们的特性，需要对他们进行单独分析。
Fig 6B Supplemental Fig 7F：作者随后使用Ro/e定量了巨噬细胞亚群的组织富集。LYVE1+巨噬细胞在不同癌肿中主要富集到非肿瘤组织，和组织原位巨噬细胞相似。
Fig 6C：此外，作者也鉴定出了多种肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)，包括SPP1+ TAMs (以这个为例做了展示)，C1QC+ TAMs, ISG15+ TAMs和FN1+ TAMs。这些细胞的功能和张老师20年的cell5中报道的类似。
Fig 6D：免疫荧光验证了THCA中SPP1+ TAMs和肾癌中FN1+ TAMs的存在。
Supplemental Fig 7G：巨噬细胞在体外做功能研究时常常被分为M1和M2，使用M1和M2的marker基因对不同癌肿间的巨噬细胞作区分，几乎所有癌肿中的巨噬细胞都同时存在M1和M2的基因特征。与既往报道相符，也提示使用M1和M2对巨噬细胞进行粗暴划分是不合理的。
Fig 6E：计算了不同癌肿中巨噬细胞的促血管生成和吞噬功能评分，发现在8个癌肿(BRCA, PAAD, LUNG, CRC, UCEC, NPC, OV-FTC和THCA)中SPP1+巨噬细胞的基因表达主要与血管生成相关，而C1QC+ TAMs显示出更高的吞噬活性。 而且两种功能的不同巨噬细胞往往同时存在于癌肿中。
Supplemental Fig 8A：在肺癌数据中使用GSEA验证了Fig 6E的结论。
Supplemental Fig 8B：作者使用TCGA的数据探究了不同癌肿间促血管生成的TAMs和临床预后的关系。整体上SPP1的高表达和患者的不良预后相关。
Fig 6F：其他血管生成marker，如肾癌中的FN1和皮肤恶性黑色素瘤中的VCAN也与不良预后相关
因此促血管相关的巨噬细胞在不同癌肿中虽然marker不同，但是都和不良预后相关。
Supplemental Fig 8C：作者随后探究了血管生成相关TAMs在健康组织中的特征基因。这里使用了human cell landscape (HCL)的数据，使用Scanorama进行了整合和标准化。结果显示这些基因在对应的正常组织中总是表达较低，提示TAMs存在特异性的TME诱导的表达模式。
Supplemental Fig 8D：尽管TIMs中促血管生成的TAMs的比例存在较大差异，在比较转录相似性时，促血管生成的TAMs更倾向于聚在一起(Fig 6A)，进一步证实了它们在肿瘤进展中存在共享的促血管生成表型和功能。
Supplemental Fig 8E：作者推测不同肿瘤类型中促血管生成的TAMs的丰度可能影响对肿瘤免疫治疗的反应。为了验证这个假设，作者探究了MEL患者免疫检查点抑制剂治疗后的单细胞数据。使用MEL中已经建立的TIMs图谱作为参考，作者使用了SciBet去预测了各种髓系细胞的特性并鉴定出了两个数据集的细胞亚群中存在的一致的模式。
Fig 6G, Supplemental Fig 8F：促血管生成的VCAN+ TAMs在responder中更低，C1QC+ TAMs则没有明显差异，提示促血管生成的TAMs在对免疫治疗的不同反应中是有影响的。
Supplemental Fig 8G：使用PAGA分析探究不同单核巨噬细胞的起源，作者比较了从CD14+单核细胞到不同巨噬细胞亚群的分化潜能。LYVE1+ RTMs和C1QC+ TAMs在不同肿瘤中都显示出和CD14+单核细胞较弱的关联性，提示它们的组织原位特性。
为了进一步探究TAMs的异质性，作者比较了自己的数据和另外一个独立的HCC单细胞数据集6。根据这篇文献报道，组织原位FOLR2+ TAMs显示出胚肝巨噬细胞特性，并且支持HCC中TME的onco-fetal reprogramming。
Supplemental Fig 8H：有趣的是，作者发现LVYE1+ RTMs和FOLR2+ TAMs以及FLMs间存在高度相似性。因此，作者假设LVYE1+ RTMs在正常组织中的存在可能是FOLR2+ TAMs的潜在起源。
Fig 6H：为了验证前面的结论，作者比较了LVYE1+ RTMs和其他巨噬细胞，发现它和C1QC+ TAMs存在很好的connectivity。值得注意的是，C1QC+ TAMs在HCC中也和FOLR2+ TAMs存在很高的相似度，提示了LVYE1+ RTMs和FOLR2+ TAMs之前存在密切关系。
Taken together, these results indicated the potential of LVYE1+ RTMs to develop into onco-fetal FOLR2+ TAMs or C1QC+ TAMs and their unexpected functions in reprogramming the TME.
7. Factors potentially shaping the composition of tumor- infiltrating myeloid cells
这个研究中的巨大样本量使得作者可以探究多种因素与不同TIM组成的相关性。
Fig 7A：作者首先在pan-cancer collection中探究了TIM组成和体细胞突变谱的关系，鉴定出了一些基因的体细胞突变与髓系细胞亚群比例相关。
Fig 7B：值得注意的是，作者鉴定出了MUC4的突变与LAMP3+ cDCs的比例相关。既往报道这个基因与通过调节肿瘤细胞凋亡促进肿瘤进展有关。
Fig 7 C D：此外，作者发现凋亡和炎症反应通路的突变和肿瘤中LAMP3+ cDCs的比例相关。
Fig 7 E：作者还在五个具有足够样本数的癌肿中检测了TIM亚群比例和肿瘤组织上调基因的相关性。结果显示THCA中PYCR1基因的表达和SPP1+巨噬细胞的比例正相关。
Fig 7 F：PYCR1这个基因编码脯氨酸生物合成的酶，在肿瘤组织中上调，但是在THCA的CD45+免疫细胞中没有检测到。鉴于脯氨酸在维持细胞氧化还原平衡和抑制凋亡中的作用，PYCR1是一个不错的肿瘤靶点，在肿瘤生长中起到了重要作用。THCA中PYCR1表达和SPP1+促血管生成相关巨噬细胞的关系提示着SPP1+促血管生成相关巨噬细胞在肿瘤发生中的潜在功能。
参考文献：
- Mast-Cell-Derived TNF Am- plifies CD8(+) Dendritic Cell Functionality and CD8(+) T Cell Priming. Cell Rep. 13, 399–411.
- Mast cells as therapeutic target in cancer. Eur. J. Pharmacol. 778, 152–157.
- Mast cells and basophils in inflammatory and tumor angiogenesis and lymphangiogenesis. Eur. J. Pharmacol. 778, 146–151.
- Landscape and Dynamics of Single Immune Cells in Hepatocellular Carcinoma. Cell 179, 829– 845.e20.
- Single-Cell Analyses Inform Mechanisms of Myeloid-Targeted Therapies in Colon Cancer. Cell 181, 442– 459.e29.
- Onco-fetal Reprogramming of Endothelial Cells Drives Immunosuppressive Macro- phages in Hepatocellular Carcinoma. Cell 183, 377–394.e21.