2022-10-07流式细胞术：对照组设置与荧光补偿调节

阴性对照设置

参考：【研究生】流式细胞术原理、荧光通道、流式图、实验对照设计等_哔哩哔哩_bilibili

屏幕截图 2022-10-07 165705.png

同型对照选择

一般抗体购买时会给推荐相应得同型对照
参考：流式检测中同型对照与二抗及封闭剂的区别？ - 知乎 (zhihu.com)
同型与一抗区别是：同型对照抗体是没有特异靶标的一抗，也就是说抗体的可变区或者说fab段(与抗原特异性结果的部位）是不一样的。其他区域是一样的。
同型对照作用：排除非特异性结合：
（1）抗体与靶细胞上的 Fc 受体结合，（2）抗体与细胞蛋白、碳水化合物和脂类的非特异性结合和。

image.png

封闭剂又叫FC受体阻断剂：意思就是，细胞表面的FC受体都是我的，你一抗别想抢，抢也抢不到。细胞上的FC受体能结合抗体的FC段，造成非特异结合。有N多种细胞的FC受体能结合FC段，但是，有三种细胞结合力相对较强，见下图，也就是表达DC64,CD32,CD16的这几种细胞（真好记，16，162=32，322=64，是巧合还是有什么我不知道的隐秘）。
从上面来看，两者差不多，又有区别。同型抗体能与FC受体结合，但是结合能力和一抗是一样的，也就是说，也就那三种细胞结合的比较多，背景噪音比较高。其他的细胞，结合很少。而FC受体阻断剂不同，管你什么细胞的fc受体，管你有没有能力结合FC段，通通封杀，不要影响抗体兄弟。抗体与细胞蛋白、碳水化合物和脂类的非特异性结合和，这点的话，同型可以解决，封闭应该解决不了。但这种结合能结合多少？影响多大？我不知道，应该没什么影响。总结：封闭剂效果更好，表现出真实的荧光强度，同型抗体可能造成背景高，对结果可能造成影响。况且，并不是每个抗体都能找到同型抗体（理论上能）。而且，封闭剂便宜。所以说，能用封闭就封闭吧！

荧光补偿问题

参考：想了解“荧光补偿”的相关知识吗？看这里！ - 知乎 (zhihu.com)
【流式集训营】FlowJo调补偿的一二式_哔哩哔哩_bilibili

哪些染料之间有荧光补偿：

1、由同一个激发光激发的荧光染料之间才会涉及补偿，例如：FITC/PE/Percp/PE-Cy5/PE-Cy7。不同激发光激发的两种荧光染料之间几乎没有补偿；例如PE和APC；

2、由同一个激发光激发的荧光染料，如果发射光谱之间有重叠部分则一定有补偿，一般而言发射光谱相邻的两种染料之间会有补偿；

3、注意耦联染料的补偿，像PE-Cy5和APC是由不同的激发光激发，但两者之间补偿太大，不能同时使用，请看如下解释：

image.png

image.png

image.png

image.png

如何调整荧光补偿呢？？？

参考：科学网—如何确定流式分析中荧光补偿是正确的呢？ - 张千君的博文 (sciencenet.cn)
在实验时直接调补偿，可以根据自己选择的染料事先看一下BD 荧光viewer，看看发射光谱有没有重叠，简单判断是否有补偿。在做预实验时，每一个通道都要做一个单染管，用来调补偿。补偿调好后正式实验直接用就可以了，不要再改变染料的体积用量，不要改变电压，一般来说，波动不会太大的。

1. 建立普通specimen:specimen_001

新建一个experiment,在这个experiment下面建立一个specimen_001，在parameter中选择合适的通道.

2. 建立补偿specimen：compensation controls

step1:如 图1： 在顶部experiment中选择compensation setup,然后create compensation controls.

image.png

step2:如 图2：勾上include seperate unstainded controls tube/well,点击ok.

image.png

step3:如 图3：在compensation conrols下建立NC管和单阳管，并分别命名。

image.png

step4: 利用NC管调整所有marker的阴性群在10^2左边，不record数据
step5：利用单阳管调整每一个单阳管marker的阳性群在视野内，不record数据
step6：step4&5调整好每个marker的电压后，将单阳管调整好的电压分别输入NC管中。并重新loadNC管和每一个单阳管，分别record数据。
step7:计算补偿：点击顶部experiment_compensation setup_calculate compensation。

image.png

跳出页面,点击link and save。

image.png

step8:点击回到global worksheet(从normal worksheet)

image.png

再点击compensation controls实验

image.png

cytometer窗口就会出现compensation值

image.png

3. 以上，补偿就调节好了，切换到specimen_001实验，直接只load一个mix管就可以自动使用调整好的补偿电压了。