生信log24|cap3拼接16S的原理——常用软件论文精读（算是新系列）

很久之前就发现很多的教程和笔记比较专注于软件是怎么使用的，即使是有笔记也仅仅是原理的翻译，这个系列我自己想写很久了，那就是扒一扒这些软件是怎么实现的，以及实现的步骤是怎样的，软件是怎么验证他们的实验数据的呢。这算是一个新的系列？前段时间一直在赶毕业论文，产出极少，现在回归中。

1、Cap3是什么

Cap3是一款DNA序列拼接软件，向我们经常用来拼接16S rRNA基因的软件Chromas和Snapgene他们内嵌的拼接程序就是Cap3。
KEGG上的EGassembler使用的拼接程序也是Cap3。

2、Cap3是怎样工作的，工作原理是什么？

工作流程：1、根据PHRED的值剪掉末端测序质量不好的reads；2、计算reads之间的重叠区域；2、去掉错误的overlaps；3、构建contigs序列重叠群；4、构建多序列比对找出重叠的区域进行拼接。

Cap3的工作流程
怎么找到overlap的？

Cap3使用的是Needleman-Wunsch全局比对（global alignment）和局部区域比对（local alignment）找到overlap的，文中也提到要更准确的话应该是要用blast工具的。

在biopython可以调用EMBOSS这个工具实现（此处截取biopython中的实现全局比对的命令），假定我们有两条序列a.fa和b.fa，输出的文件为needle.txt

from Bio.Emboss.Applications import NeedleCommandline
needle_cline = NeedleCommandline(asequence="a.fa", bsequence="b.fa",\
                                                            gapopen=10, gapextend=0.5, outfile="needle.txt") 
#这个相当于在终端运行了needle的程序如果有单独安装emboss的工具也可以在终端运行下面的命令
needle -outfile=needle.txt \
-asequence=alpha.faa -bsequence=beta.faa \
-gapopen=10 -gapextend=0.5

### 运行比对程序
stdout, stderr = needle_cline()
print(stdout + stderr)

### 读取输出得到的结果文件
from Bio import AlignIO
align = AlignIO.read("needle.txt","emboss")
print(align)

怎么判断overlap的，程序的评分标准是什么
overlap首先需要同时满足长度（length），同源性（percent identity），相似度similarity的最低要求（这个分值多少应该是人为设定的）；
其次overlap的碱基需要在测序质量高的区域内。

3、什么数据能使用Cap3进行拼接？

Cap3开发的目的是为了给当时的shotgun测序得到的数据使用的，目的是把小片段拼成contig，也算是基因组拼接的工具之一。
现在发现它非常适合双端测序数据的拼接，因此sanger测序的数据也可以使用。

4、Cap3跟以前的拼接软件比有什么优势？Cap3解决了当时的什么技术问题

1、根据上下游的特异性引物去进行拼接DNA片段，这个Forward-reverse constraint原文中直译过来就是两条在特定区域DNA正负链上的reads（日常用的PCR引物就是这样的功能）
（A forward–reverse constraint specifies that the two reads should be on the opposite strands of the DNA molecule within a specified range of distance）

lane上面有污染怎么办，怎么处理错误的overlap。Cap3对此设置了阈值进行过滤，因为出现错误overlap为小概率事件，大部分序列能找到正确的overlap。

2、

5、利用Cap3+shell批量拼接16s序列

目前还没使用过本地版的，往后体验过会更新。

附带一个本地版的教程

2022.03.14 目前先写到这里。