测序知识

重新学习测序的相关知识

一代测序

Sanger 测序法是第一代基因测序的基本原理，2001年完成的人类基因组框图，采用的也是Sanger法。Sanger法直到今天还在广泛使用，准确率高，被称为基因检测的金标准。

原理

简单来说就是采取DNA复制原理，通过在DNA复制过程中添加双脱氧三磷酸核苷酸（ddNTP在DNA的合成过程中不能形成磷酸二酯键，因此可以用来中断DNA的合成反应）终止DNA链的延伸，在DNA链不同位置的延伸终止判断该位置的碱基类型

步骤

1. 首先，将待测序的DNA扩增，就是复制出很多相同的DNA，准备足够的样本量。
2. 接下来，加热，使DNA变性。双链DNA就分离开来，成为单链DNA，只留下下面的单链，称为模板链。
3. 将测序引物（primer）和模板链结合，从5’位置开始，加入引物是因为DNA聚合酶不能从头复制需要前面有一小段起点
4. 然后将添加完测序引物的DNA平均分散在四个反应容器中。
5. 接下来，将DNA聚合酶加入到所有四个反应容器中。
6. 继续将四个基本碱基的原料（dNTP），这些原料还是单个的脱氧核糖核酸，加入到每个反应容器
7. 接下来，关键步骤来了，加入特异性ddNTP到反应容器，每个反应容器中只加入一种ddNTP
   特异性ddNTP可以和对应的碱基结合，但是和普通碱基不同的是，当他们和对应碱基结合后，可以终止后续的其他结合，就是DNA的链式反应就结束了。这样就产生很多一边完整（模板单链），一边不完整（因为ddNTP的存在）的DNA分子
8. 聚合酶将各个碱基连接到模板链上，ddNTP与模版的结合是随机的，有的先结合，有的后结合
9. 等到反应结束后，将这四个容器内的产物，放置到电泳胶上。
10. 最后从底往上读取，就可以得到DNA的顺序。

二代测序（Next Generation Sequencing 第二代测序技术）

二代测序有三种

1. 罗氏454公司的GS FLX sequencer
2. illumina solexa genome analyzer
3. ABI公司的SOLiD sequencer
   三种里，illumina应用较多，下面就介绍illumina吧

illumina测序的核心

1. 一个是桥式PCR，主要用于扩大信号
2. 另一个用不同颜色的荧光标记四种不同的dNTP，当DNA聚合酶合成互补链时，每添加一种dNTP就会释放出不同的荧光。使illumina测序可以实现边合成边测序的技术（主要）

步骤

1. 建库

• 先打断成一定长度的片段
• 打断以后会出现末端不平整的情况，用酶补平，所以现在的序列是平末端。
• 完成补平以后，在3'端使用酶加上一个特异的碱基A
• 加上A之后就可以利用互补配对的原则，加上adapter（一段特定的序列，有类似于引物的功能），这个adpater可以分成两个部分，一个部分是测序的时候需要用的引物序列，另一部分是建库扩增时候需要用的引物序列
• 进行PCR扩增，使得我们的DNA样品浓度足够上机要求

2. 桥式PCR
   将DNA样品调整到合适的浓度加入到flowcell（测序反应发生的位置，1个flowcell含有8条lane）中，再加入特异的化学试剂，就可以使得序列的一端与flowcell上面已经存在的短序列通过化学键十分强健地相连，图中不同的颜色表示的是两种不同的adpater，分别对应序列之前加入的两种adpater

   
   
   这就是flowcell
   
   
   加入到flowcell结合是这样的

• 和flowcell进行匹配，连接以后就正式开始桥式PCR。首先进行第一轮扩增，将序列补成双链。加入NaOH强碱性溶液破坏DNA的双链，并洗脱。由于最开始的序列是使用化学键连接的，所以不会被洗。
• 加入缓冲溶液，这时候序列自由端的部分就会和旁边的adpater进行匹配

• 合成一条相反的链，然后它的另一个adapter就会和flowcell的adapter相匹配，进行第一次桥式PCR，图2是完成第一轮桥式PCR

  
  
  桥式PCR

• 然后两条链进行加热打开，一条是前导链，一条是后随链

  
  
  image.png

• 之后进行无数轮的扩增，如此循环下去，就会得到一个具有完全相同序列的簇，一般叫cluster，形成这种1个cluster，1个cluster的形态，在整个flowcell中看上去，示意图如下。其中的每1个cluster就算是1群完全相同的序列。

  
  
  image.png

3. 测序

• 就是来一个primer，然后加入特殊处理过的A，T，C，G四种碱基。特殊的地方有两点，一个是脱氧核糖3号位加入了叠氮基团而不是常规的羟基，保证每次只能够在序列上添加1个碱基；另一方面是，碱基部分加入了荧光基团，可以激发出不同的颜色。
• 在测序过程中，每1轮测序，保证只有1个碱基加入的当前测序链。这时候测序仪会发出激发光，并扫描荧光。因为一个cluster中所有的序列是一样的，所以理论上，这时候cluster中发出的荧光应该颜色一致。
• 随后加入试剂，将脱氧核糖3号位的—N2改变成—OH，然后切掉部分荧光基团，使其在下一轮反应中，不再发出荧光。如此往复，就可以测出序列的内容。