文献(5): 单细胞转录组揭示人类纤维化皮肤病中成纤维细胞的异质性

一句话评价：小样本量单细胞转录组在冷门疾病领域应用前景尚可，常规套路也能发NC

1. Title

标题可以看出本研究的主要内容：①构建成纤维细胞的图谱/揭示成纤维细胞的异质性；②找到一群（相对于正常样本）在纤维化皮肤病中含量升高的间充质成纤维细胞

2. Background

1. 纤维化的特点是成纤维细胞增殖、迁移、侵袭能力增加以及胞外基质 (ECM) 的过度积累，在全球范围内都有较高的发病率和死亡率。 纤维化皮肤病主要是 ECM 在真皮中积累
2. 纤维化可影响任何器官，导致进行性组织瘢痕形成和器官功能障碍
3. 迄今为止，纤维化皮肤病的发病机制尚未完全阐明，仍缺乏根治性治疗方法
4. 尚缺乏关于 scRNA-seq 探索纤维化皮肤病成纤维细胞异质性的研究

——> 所以要做single cell

3. Results

3.1. 单细胞测序揭示正常伤疤和纤维皮肤病瘢痕的(真皮层)细胞异质性

keloid在此处表示瘢痕/“病灶”

都是很常见的图：

• a.流程图，比一般情况多了酶解这一步，目的是消除表皮层的细胞
• b.umap降维，展示cluster注释信息
• c.层次聚类，表示cluster表达谱的相似性
• d.各种细胞组分在每个样本中的占比

3.2 成纤维细胞被分为4群，其中间充质类型的成纤维细胞在疾病组织中增多

• a, c, d, e. 在上一步的基础上，提取出成纤维细胞重新降维， 聚类。结合已有文献，最终注释为4群，其中间充质成纤维细胞表达一些间充质祖细胞marker，如 COL11A1 和 POSTN，它们参与骨骼系统发育、骨化或成骨细胞分化。促炎成纤维细胞的特征包括炎症反应、细胞趋化性和胶原蛋白表达减少
• f. 只有间充质类型的成纤维细胞(Mesenchymal fibroblasts,MF)在疾病组织中升高
• h. 对比这种MF在疾病、正常之间的差异，发现疾病状态下，MF高表达骨骼系统发育、骨化相关通路和基因，比如COL11A1, COMP, POSTN

不知道大家读到这里有没有跟我一样的困惑：①某个细胞类型和其他细胞类型做对比，②这种细胞内部不同condition做对比，得到的差异基因和通路这么像？！

3.3 疾病组织中，间充质成纤维细胞的特征

（也就是在疾病组织中，将MF和其他成纤维细胞做对比）

• b. 差异基因
• d. 差异通路主要分了三块：胶原蛋白(ECM的成分)相关、伤口愈合相关、骨化相关
• e. 这个图是看的转录调控，并没有采用常见的单细胞转录组中分析转录调控的方法。右边的小提琴表示TF在MF与the rest之间的表达差异。左边的图，每个TF对应一行，一行里面有两小行，列表示按照logFC排序后的基因，越往左表示MF中高表达的基因，越往右，表示the rest中高表达的基因。如果某个调控网络(TF加靶基因)在某个群中存在，则应该满足：TF高表达、TF正向调控的基因高表达、TF负向调控的基因低表达。以SCX为例，它在MF中高表达，它激活的基因(红色表示)在MF中高表达(因为这些基因排在左边)，它抑制的基因(蓝色表示)在MF中低表达(因为这些基因排在右边)，结合这几点共表达信息，就支持了MF中存在SCX的调控网络。通过这个分析，找到了MF中特有的调控网络，并和它上调的通路是吻合的。

• 荧光染色验证这群MF在疾病组织中存在，在正常组织中很少

3.4 细胞通讯分析

• 找到了疾病组织中显著的interaction
• 探究MF在细胞互作中所起的角色，MF有哪些重要的interaction

3.5 疾病真皮组织中MF通过POSTN促进胶原蛋白的表达

接着是做了一点点机制。关于为什么要做这个基因，正文没有说太多，只说是：①这个基因在MF中高表达；②此前已有一些报道称POSTN可以促进瘢痕组织的形成，可以促进胶原蛋白(一种ECM成分)的产生。

• a. 通过单细胞转录组分析中得到的marker，将成纤维细胞分选为MF和other fibroblasts
• d. 对这两组细胞做了bulk RNA-seq，证明分选效果比较好，得到了想要的细胞

• g. 将两组细胞培养后，取上清液加到other fibroblasts里面，发现MF的上清液能使两种胶原蛋白表达升高
• h. 加入POSTN的中和抗体后，这种现象被抑制了

通过一正一反的实验就证明了MF通过POSTN促进胶原蛋白表达的结论

3.6 MF的两个子类有什么关系

在3.2中，其实是把两个子类都归为MF了，这一部分就探究了它俩的关系。

• a, b. diffusion map，这里只能看出降维信息，两类并不重合
• c. mesenchymal progenitor marker genes在cS4中高表达(说明cS4可能是更早期的状态)
• d. RNA velocity分析给出了几条可能的转化路径
• f. 比较了cS4和cS1的差异，发现cS4更加具有间质特征

3.7 其他数据集也能发现这种MF细胞

• a. 别人的数据集(硬皮症，也是一种纤维化皮肤病)的降维注释结果；本研究中某个正常样本数据集的降维注释结果
• b, c. 提取上一步分析中两个数据集的成纤维细胞，整合，降维聚类
• d. MF的marker基因在降维图中的投影，发现在cluster 7中，这些marker高表达，且疾病组织比正常组织高表达
• e. cluster 7与本研究中4种成纤维细胞亚群的相关性热图，cluster 7和MF的相关性最高

结论是其他数据集也能找到这种MF，说明纤维化皮肤病存在一种广泛的致病机制

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4. ref

Single-cell RNA-seq reveals fibroblast heterogeneity and increased mesenchymal fibroblasts in human fibrotic skin diseases

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（2021.10.22组会分享的文献，因为准备时间有限，就选了这一篇较简单的）

我之前有想过一个问题，对于单细胞转录组数据，两组比较之后，如果已经找出有丰度差异的亚群，接下来的重点是：
①研究这一群的特征
还是
②比较这一群里面两组之间的差异
我当时是觉得①更好，因为把这种亚群的特征研究清楚了，反映的就是组间差异（富含这种亚群的condition，也具有更明显的这种亚群的特征）。另一方面②中的比较，因为细胞注释是相同的，这样做可能得不出什么差异或者差异很小(假设虽然有丰度差异，但都有一定的细胞量)。

这篇文献的前半部分cluster之间以及condition之间的比较都得出相似的结果，跟我之前想的有点不一样...

因水平有限，有错误的地方，欢迎批评指正！