单细胞RNA测序揭示细菌性肺炎继发脓毒症发病机制中的免疫细胞功能障碍
背景知识：
在脓毒症期间，宿主对感染病原体的免疫反应失调会导致器官功能障碍。在已知的感染性病原体中，革兰氏阴性菌是主要的致病菌，在严重脓毒症患者中占62%的阳性培养。PBMC是评价脓毒症患者全身免疫状态最常用的样本。
发现问题：
在脓毒症期间，先天免疫细胞和获得性免疫细胞都表现出长期功能失调的特征。
结果：
细菌性肺炎继发脓毒症发病过程中免疫细胞全部景观
作者从2例革兰氏阴性菌肺炎继发脓毒症患者中分离出PBMC，并用进行scRNA-seq检测来探讨细菌性肺炎继发脓毒症所致免疫细胞图谱的动态变化。采集患者样本，分急性期、稳定期和恢复期三个阶段。第一例急性期患者的样本由于细胞质量低而无法进行scRNA-seq检测，作者对来自健康对照(ID：HC-1)的PBMC进行了scRNA-seq，并结合从10×基因组学下载的另外四个来自健康对照的scRNA-seq数据集(ID：HC-2、HC-3、HC-4、HC-5)进行了比较。批次效应校正后，对所有样品的细胞进行整合(Fig. 1A, B)。随后，共对52,412个细胞进行了进一步分析，无监督聚类识别出三个类(Fig. 1B)。 这三个簇都是由每个样本的细胞组成的，这表明批次效应得到了很好的校正(Fig. 1C)。根据典型细胞标记基因，将其进一步标注为T/NK细胞(CD3D+IL32+NKG7+)、髓系细胞(CD14+FCGR3A+S100A9+)和B细胞(CD79B+CD79A+IGHM+)(Fig. 1D, E)。接下来，作者计数了每个疾病阶段和健康对照组的免疫细胞组成，以揭示疾病进展过程中的实质性变化。细菌性肺炎继发脓毒症患者T/NK细胞和B细胞减少，髓系细胞扩张。与正常对照组比较，细菌性肺炎继发脓毒症患者T/NK细胞和B细胞减少(Fig. 1F)。在疾病过程中发生了意想不到的变化。T/NK细胞比例持续下降，髓系细胞比例持续升高，恢复期尤为明显(图1F)，提示恢复期仍存在免疫细胞紊乱。
Fig. 1.Study design and single-cell transcriptomic landscape of PBMCs from patients with sepsis secondary to bacterial pneumonia and healthy controls.
干扰素反应和TNFA信号在肺炎继发脓毒症发病机制中的上调
为了进一步剖析肺炎继发脓毒症发病的分子机制，作者对各个疾病阶段和健康对照组之间的所有差异表达基因进行了通路富集分析，以期找到疾病状态下发生变化的信号通路(Fig. 2A, B, C)。与健康对照组相比，所有三个阶段的患者都表现出干扰素γ反应上调。与稳定期相比，恢复期的患者也表现出干扰素γ反应和干扰素α反应的上调。此外，干扰素应答基因包括IFNGR1、IFITM2、IFITM3、IFI6、ISG15和ISG20在疾病进展过程中呈增加的现象(Fig. 2D)。提示干扰素反应在疾病过程中的可能起到持续性作用。与健康对照组相比，急性期和恢复期通过NFκB的TNFA信号也上调(Fig. 2A, C)。恢复期患者与稳定期患者相比，NF-κB信号转导上调，而与健康对照相比，NFκBIA、JUNB、TNFAIP3、CCL4和SOCS3等参与该通路的基因在疾病分期中高表达(Fig. 2D)。作者接下来为了探索病程和健康对照组之间的这些途径改变是否由某些细胞亚型驱动，进一步扩展了所有免疫细胞亚群中的通路富集分析。结果显示，干扰素γ反应在T/NK细胞的所有疾病阶段都上调(Fig. 2E)。这提示T/NK细胞在疾病进展过程中可能参与干扰素γ反应的上调。在与健康对照组相比中，髓系细胞急性期和恢复期的TNFA通过NFκB信号通路上调(Fig. 2F)。提示髓系细胞可能与病期NF-κB上调TNFA信号有关。与急性期相比，NF-κB介导的TNFA信号在稳定期下调，而在恢复期与稳定期相比上调，提示稳定期炎症消退，但在恢复期，炎症却聚集。然而，在B细胞中，mTORC1信号在所有疾病阶段都上调，在恢复期比稳定期下调。这一信号仅在急性期与健康对照相比上调(Fig. 2A)。这提示肺炎继发脓毒症中信号通路的整体改变可能与T/NK细胞和髓系细胞有关。接下来，作者探讨了疾病进展过程中基因表达的动态转录变化。发现了8个具有不同时间依赖表达模式的簇，并对这些簇中的基因的生物学功能进行了评估(Fig. 2G)。Cluster1由2989个基因组成，这些基因在病程过程中表达下降。簇1中基因的功能主要为自噬功能(Fig. 2G)。以往的研究表明，脓毒症时由于自噬的修复导致近端肾小管功能障碍，提示Cluster1基因的动态表达可能与脓毒症肾脏损伤有关。簇6包含2283个在疾病阶段持续增加表达的基因。这些基因对I型干扰素的产生具有调控作用(Fig. 2G)。并且与干扰素反应基因在疾病阶段的表达上调是一致的(Fig. 2D)。
Fig. 2.Interferon response and TNFA signaling were upregulated during the pathogenesis of sepsis secondary to bacterial pneumonia.
细菌性肺炎继发脓毒症患者T细胞和NK细胞持续耗竭和凋亡特征
由于T细胞和NK细胞是健康对照组的主要细胞群，且在细菌性肺炎继发脓毒症的过程中呈持续下降趋势，其在不同疾病阶段的组成和分子变化可能反映疾病进展的严重程度。因此，作者接下来对T/NK细胞进行了重新聚类，更精细分析它们的动态变化。生成了10个簇，并通过UMAP图进行了可视化(Fig. 3A)。根据细胞标志基因将CD4+T、CD8+T相关亚型分类 (Fig. 3B)。为了进一步了解每个亚型的功能，作者进行了基因本体论(GO)分析。CD8+Tem细胞、Treg细胞、PRO-T细胞、CD8+Te细胞和NK细胞参与干扰素-γ的应答(Fig. 3C)。此外，干扰素-γ反应基因包括干扰素受体(IFNGR1)、ISG15、IFI44L、IFI6和IFITM3的表达模式不同，几乎所有T和NK细胞亚型在病程中的表达水平均高于健康对照组。所有亚型都有丰富的淋巴细胞活化(Fig. 3C)。同时，T细胞活化的标志物CD69+在疾病状态下也比健康对照组高表达，提示T细胞和NK细胞的免疫应答被激活(Fig. 3D)。而CD4+TPM细胞、NKT细胞、CD4+、CD28+T细胞、CD8+Te细胞和NK细胞参与了凋亡过程的正向调控，提示T细胞处于免疫抑制状态(Fig. 3C)。脓毒症的免疫抑制主要表现为淋巴细胞，尤其是T细胞的凋亡和耗竭。进一步检测促凋亡相关基因，如TNFSF10、TNFRSF1B、BCL2L11和CASP3等基因的表达，发现包括PRDM1和LAG3在内的T细胞耗竭相关标志物在所有T和NK细胞亚型(CD4+CD28+T细胞除外)的疾病进展过程中均上调(Fig. 3D)。接下来，作者研究了细菌性肺炎继发脓毒症进展过程中T和NK细胞亚群的免疫学变化。从细胞组成的角度来看，T细胞和NK细胞在疾病状况和健康对照组之间呈现出不同的表达。脓毒症患者CD4+TN细胞和CD8+TN细胞明显减少，提示这些细胞亚群处于免疫抑制状态。这两种细胞在病情发展过程中均表现出相似的下降趋势，急性期开始下降，稳定期略有增加，恢复期进一步下降(Fig. 3E)。CD8+Te细胞和CD8+Tem细胞的比例在病程中呈上升趋势，这与CD8+Te细胞和CD8+Tem细胞在淋巴细胞活化中的作用一致，提示它们的免疫效应增强。CD8+Te细胞和CD8+Tem细胞随病期升高趋势相似，急性期升高，稳定期略有下降，恢复期持续升高(Fig. 3E)。此外，与健康对照组相比，NK细胞在疾病过程中的比例增加。健康对照组和急性期的NK细胞比例相当，但在随后的两个疾病阶段，NK细胞比例逐渐升高(Fig. 3E) 为了进一步探讨NK细胞的细胞和功能变化。作者再次进行了重新群集，并将NK细胞分为两个群集：NK1和NK2(Fig. 3F)。NK1高表达FGFBP2、GZMB和FCGR3A，参与细菌、吞噬和I-kappaB激酶/NF-kappaB信号转导（Fig. 3G)。NK2高表达GZMK、XCL1和KLRC1，参与淋巴细胞活化、细胞因子介导的信号通路和细胞杀伤（Fig. 3G) 细胞成分分析揭示了NK细胞亚群的动态变化。NK细胞亚群以NK1为主。NK1在急性期和稳定期升高，然后下降到与正常对照组相似的水平，而NK2则呈现相反的趋势，表明恢复期患者NK细胞的细胞比例有所恢复(Fig. 3H)。然而，即使在恢复期，NK细胞在疾病阶段仍表达高水平的耗竭和凋亡标记基因，这表明尽管恢复了细胞组成，但恢复期患者的NK细胞功能仍然存在(Fig. 3D)。
Fig. 3.T and NK cells presented sustained exhaustion and apoptosis features in sepsis secondary to bacterial pneumonia.
髓系细胞主要在恢复期表现出失调
在作者的数据中，髓系细胞是不同疾病阶段的主要改变细胞群，表明对脓毒症有强烈的免疫学反应。然后，作者对总的髓系细胞进行了重新分类，以进一步探讨细菌性肺炎继发的脓毒症引起的动态转录改变。随后，获得了8个聚类，并利用UMAP图进行了直观的分析(Fig. 4A)。根据细胞标记将其分为6种单核细胞亚型(CD14+/FCGR3A+)、巨核细胞(MK, PF4+PPBP+)、树突状细胞(DC, JCHAIN+SEC11C+) (Fig. 4B)。这些细胞亚群的功能特征是不同的，GO分析揭示了这些细胞亚群的功能特征。几乎所有的细胞亚型都参与调节细胞因子的产生和对细菌的应答，表明单核细胞处于激活的免疫状态(Fig. 4C)。CD14+MonO2、CD16+Mono、CD24+Mono、HLA-DR+Mono和LDHB+Mono参与淋巴细胞活化(Fig. 4C) 而CD14+Mono2和CD16+Mono在正向调节细胞死亡、凋亡信号通路、负向调节细胞增殖和负向调节免疫系统过程中富集显著(Fig. 4C)。提示髓系细胞特别是单核细胞可能参与了淋巴细胞活化和凋亡的调节。由于与健康对照组相比，髓系细胞在三个疾病阶段表现出持续增加的趋势，作者接下来以更细致分析这种表型是否存在。因此，作者对疾病进展过程中的成分变化有了更深入的了解。出乎意料的是，急性期和稳定期的髓系细胞亚型比例与健康对照组相当。一种新发现的单核细胞类型CD24+Mono是在恢复期特异性地出现的，它在调节胞吐、对细菌的反应和对其他生物的防御反应中发挥作用(Fig. 4C, D)。然而，这种新的细胞类型主要来源于第一例患者，这表明脓毒症患者个体之间的特性是不同的。髓系细胞的功能改变主要集中在恢复期，疾病期与健康人之间的差异表达基因集中在恢复期，尤其是恢复期的髓系细胞功能主要表现为髓系白细胞活化、细胞因子产生的正调节、巨噬细胞和对细菌起源分子的应答(Fig. 4E)。提示在恢复期患者中，髓系
细胞参与的激活免疫反应仍然存在。
Fig. 4. Myeloid cells displayed functional dysregulation mainly in the recovery stage.
肺炎继发脓毒症过程中浆细胞的扩张
细菌性肺炎继发脓毒症时B细胞耗尽。然而，在不同的疾病阶段中，它们的比例没有明显的变化。这促使作者以更精细的方式探索细胞和分子的变化。因此，使用UMAP将B细胞重新聚为三个簇并直观的展示(Fig. 5A)。第0簇表达高水平的TCL1A、IGHD和IL4R，参与免疫效应过程、B细胞增殖和淋巴细胞的调节，被定义为B幼稚细胞(B naive cells，Bn)。(Fig. 5B, C) 与B细胞分化相关的簇1高表达AIM2、TNFRSF13B和CD27被鉴定为B记忆细胞(BM) (Fig. 5B, C)。簇2由于MZB1、IGHG3和JCHAIN的高表达被注释为浆细胞(Fig. 5B) 此外，浆细胞还具有丰富的多种功能，包括抗原处理和提呈、信号肽处理、抗原处理和通过MHC I类分子提呈多肽抗原以及参与白细胞活化(Fig. 5C)。根据浆细胞所具有的多种功能，在疾病的不同阶段，浆细胞所占比例均高于健康对照组，稳定期达高峰，恢复期相对下降(Fig. 5D)。接下来，作者试图研究急性期和稳定期浆细胞增殖的潜在机制。作者试图探索NK细胞和浆细胞之间潜在的调控网络，以剖析NK细胞对浆细胞增殖的影响。在急性期和稳定期，IFNG和HLA-DRA显示了丰富的配体和靶基因的调节潜力。并且与健康对照组相比，HLA-DRA在三个疾病阶段的表达水平的变化规律与浆细胞比例的变化规律相似(Fig. 5E)。这提示HLA-DRA表达的变化与浆细胞的增殖是平行的。为探讨IFNG对HLA-DRA的调控机制，推测了IFNG与HLA-DRA之间潜在的信号转导途径，IFNG可能通过EP300、STAT1、SPI1和RFX5等途径调控HLA-DRA (Fig. 5F) 。提示NK细胞与浆细胞的潜在细胞间相互作用通过IFNG信号通路对浆细胞的增殖起着至关重要的作用。
Fig. 5. Expansion of plasma cells in the process of sepsis secondary to pneumonia.
单核细胞可能通过IL1B信号通路促进T细胞增殖和耗竭
T细胞既有免疫激活状态，又有免疫抑制状态，作者观察到不同的单核细胞亚群调节淋巴细胞活化，并参与细胞凋亡途径。此外，研究还表明脓毒症患者的T细胞功能以单核细胞依赖的方式受到抑制。作者的下一个目标是探索单核细胞和T细胞之间是否存在细胞内相互作用。因此，作者构建了单核细胞与不同疾病阶段T细胞之间可能的细胞相互作用网络，以研究单核细胞是否影响T细胞的激活和抑制。作者为了探讨单核细胞在T细胞活化中的作用，选择了CD14+Mono2、CD16+Mono、CD24+Mono、HLA-DR+Mono和LDHB+Mono等单核细胞亚群作为sender cells，因为它们与淋巴细胞激活高度相关。 CD8+Te细胞和CD8+Tem细胞被选为receiver cells，因为CD8+Te细胞和CD8+Tem细胞在疾病各个阶段的比例比健康对照组持续增加。根据CD8+Te细胞和CD8+Tem细胞在疾病诱导时的差异表达基因，NicheNet被用来预测选定的单核细胞与T细胞之间的相互作用。在CD8+Te细胞中，配体与相应受体的相互作用集中在恢复期，而在急性期则很少(Fig. 6A)。同时，在恢复期，选定的单核细胞与CD8+Tem细胞之间的配体-靶标相互作用也很丰富(Fig. 6B)。因此，作者主要集中在恢复期配体介导的细胞内相互作用。有趣的是，在预测的配体中，作者发现IL1B在CD8+Te细胞和CD8+Tem细胞的调节中由选定的单核细胞表达此外，S100A9、Jun和S100A8是受IL1B潜在调控的CD8+Te细胞和CD8+Tem细胞的共同靶基因(Fig. 6A, B)。进一步分析IL1B与其靶基因之间潜在的信号转导途径，发现了一些转录调控因子，包括SPL1、relA、FOS、EP300、STAT3、IRAK1和MYC(Fig. 6C) 对于CD4+TN细胞，配体-靶点的相互作用集中在急性期和稳定期，但在恢复期不能预测，因为在恢复期和健康对照组之间没有发现差异表达的基因(Fig. 6D)。对CD8+TN细胞的进一步分析表明，配体-靶点相互作用在疾病的各个阶段都有所富集，提示所选的单核细胞可能在疾病进展过程中对CD8+TN细胞发挥其调节功能(Fig. 6E)。特别有趣的是，PRDM1被发现在不同疾病阶段的T细胞亚型中表达上调，支持单核细胞可能促进以PRDM1为靶点的CD4+TN细胞和CD8+TN细胞的耗竭。此外，还观察到一些转录调控因子如SPL1、IRAK1、STAT3、RELA、SMAD3和PRTN3与IL1B-PRDM1信号通路有关(Fig. 6F)。
Fig. 6.Monocytes might facilitate the proliferation and exhaustion of T cells through IL1B signaling pathways.
细菌和病毒肺炎继发脓毒症的免疫应答差异
干扰素应答相关基因IFITM2、IFITM3、ISG20和ISG15在三种脓毒症病因中均有高表达，其中IFITM2和IFITM3在三种脓毒症病因中的表达变化与它们之间干扰素γ应答的变化是一致的(Fig. 7A)。所有的细胞亚群在已下载的scRNA-seq数据集中进行了注释(Fig. 7B, C)。SARS-COV-2诱导的脓毒症和流感病毒诱导的脓毒症T/NK细胞比例均低于细菌性脓毒症(Fig. 7B)。然而，无论是SARS-COV-2诱导的脓毒症还是流感病毒诱导的脓毒症，与细菌性脓毒症相比，髓系细胞和B细胞的比例都更高(Fig. 7C)。有趣的是，当比较脓毒症的三种病因时，通路富集分析显示上述细胞亚型的干扰素γ反应上调。与细菌性脓毒症相比，SARS-COV-2诱导的脓毒症患者CD14+Mono1、NK1细胞、CD4+TPM细胞、CD8+Tem细胞、CD8+Te细胞、BM细胞和Bn细胞的干扰素γ应答上调(Fig. 7D)。因此，作者研究了细菌性脓毒症、SARS-COV-2诱导的脓毒症和流感病毒诱导的脓毒症的T细胞的耗竭和凋亡特征是否存在差异。令人惊讶的是，SARS-COV-2诱导的脓毒症的耗竭和凋亡水平最高，其次是流感病毒诱导的脓毒症，最后是细菌性脓毒症，反映在PRDM1，CASP1，TNFSF10和TNFRSF1B的表达上(Fig. 7E)。
Fig. 7. Different immunological response presented between sepsis secondary to pneumonia induced by bacteria, influenza virus and SARS-COV-2.
文章小结：
本研究探讨了革兰氏阴性菌肺炎继发脓毒症时循环免疫细胞在单细胞分辨率上的动态变化，为疾病进展过程中潜在的免疫应答机制提供了初步的研究结果。
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