一种诱导培养多功能干细胞产生人类卵精细胞的方法

人类生殖细胞谱系起源于人类原始生殖细胞（hPGC）。生殖细胞发育过程中的关键事件和细胞命运转变在整个哺乳动物物种中都得到了很好的保存。但是，在每个细胞命运过渡的时间尺度，发育同步性以及发育同源细胞类型的信号传导，转录和代谢特性方面，存在关键的物种差异。因此，需要更多的研究来更好地了解不同物种中哺乳动物生殖细胞发育的机制。研究人类生殖细胞发育的机制尤为重要，它与诸如不育症和后代的遗传/表观遗传疾病等关键疾病直接相关。在这里，我们描述了一种在体外将人诱导多能干细胞（hiPSCs）分化成卵原细胞的实验方案。该方案适用于研究hPGC规范和表观遗传重编程的机制。

方法概述     

下图示意性地说明了通过人原始生殖样细胞（hPGCLCs）诱导hiPSC生成卵原细胞和视黄酸反应性胎儿生殖细胞（RA-responsive FGCs）的整个过程。在异种重组卵巢（xrOvaries）中，从人诱导多能干细胞（hiPSCs）诱导人原始生殖样细胞（hPGCLCs）约需8天，从人原始生殖样细胞（hPGCLCs）诱导的卵原细胞约10d周，而在异种重组卵巢中诱导的视黄酸反应性胎儿生殖细胞（RA-responsive FGCs）约需4个月。

首先，在无饲养层条件下培养的hiPSCs通过激活素A CHIR99021（WNT信号的激活剂）的刺激而诱导进入中胚层样细胞（iMeLC）。然后，在ROCK抑制剂Y-27632存在下，用骨形态发生蛋白4（BMP4），干细胞因子（SCF），白血病抑制因子（LIF）和表皮生长因子（EGF）刺激，将iMeLC诱导为hPGCLC。在诱导的第6天，将游离的聚集体解离，并通过FACS将hPGCLC分离为BT + AG +cell。为了产生异种重组卵巢（xrOvaries），hPGCLC和小鼠胚胎卵巢体细胞以5000：50000–75000的比例在漂浮聚集条件下培养2天。产生的聚集体（xrOvaries）通过玻璃毛细管转移到Transwell培养系统中进行气液界面培养，可以持续培养约5个月，每3天更换一半培养基。人原始生殖样细胞衍生的细胞被认为可以引发全基因组DNA脱甲基化，并且通常在培养约35天时开始表达卵性/性腺细胞发育的特征基因。hPGCLC衍生细胞能够继续进行全基因组DNA去甲基化，并在异种重组卵巢培养约10周后达到约20％的水平。

总结

这里我们对这一方法进行简要的介绍，具体的实验步骤，试剂仪器准备，本方法的局限性以及操作中问题的应对，大家可以参考原文https://doi.org/10.1038/s41596-020-0297-5。