2019-01-02

13.对筛选出来的编码BPAF复合物特殊组份的基因进行体外验证。

慢病毒包装：将靶向Arid2，Brd7和Pbrm1的gRNA序列克隆到PLKO3G-GFP载体中并通过测序确认，将gRNA构建体与pCMV-dR8.91和pCMV-VSV-G（Addgene＃8454）共转染到HEK293T细胞中，48h后收割病毒。

构建Arid2，Brd7和Pbrm1基因单独敲除的稳定转染细胞系：将收割的病毒感染靶细胞B16F10-Cas，然后使用BD FACS AriaII根据GFP的表达对感染的细胞进行分选。

体外验证编码BPAF复合物特殊组份的三个基因：BD FACS AriaII的筛选得到的Arid2，Brd7或Pbrm1被单独缺陷的B16细胞（GFP阳性）与对照组B16F10细胞（GFP阴性）1：1混合，γIFN刺激之后与Pmel-1T细胞共培养然后通过FACS测定存在或不存在T细胞时突变体B16F10细胞的倍数消耗，比较突变细胞（GFP阳性）与对照B16F10细胞（GFP阴性）的百分比。

得到的结果为figure3中的C，从图中可以看到，与对照组细胞和不存在T细胞的情况相比，Arid2，Brd7和Pbrm1单独突变的B16F19细胞中（细胞中的BPAF复合物被功能失活），Arid2，Brd7和Pbrm1缺陷的B16F10细胞中大部分肿瘤细胞被Pmel-1T细胞杀伤，而且Cd274表达也被抑制。尤其是Arid2和Pbrm1缺陷的B16F10细胞更为明显。

14.蛋白质免疫印迹分析Arid2，Brd7和Pbrm1基因敲除后其相应的蛋白质表达情况。

结果为figure3中的图B，在图B中可以看到，与对照组相比，在Arid2敲除细胞系中（第一行），Arid2的表达量明显下降但也不是完全没有。

第二行：与对照组相比，在Brd7敲除细胞系中，除了Brd7表达量下降以外，Arid2的表达量也相应的减少。这说明了Brd7影响Arid2的表达。

第三行：与对照组相比，在Pbrm1突变的细胞系中，Pbrm1几乎没有表达量，但还是有很少的蛋白量。而Arid2的表达量也稍微减少。

该结果表明了Pbrm1和Brid能够影响Arid2的表达，而Arid2对Pbrm1和Brid的表达没有影响。而且B16F10细胞系任然存在部分染色质重塑复合物的活性。

15.目的：B16F10肿瘤细胞对PD-1和/或CTLA-4 抗体的检查点阻断具有抗性，因此我们检测Pbrm1的失活是否会导致B16F10肿瘤细胞对检查点阻断敏感。使用Pbrm1缺陷型B16F10-Cas细胞注射到小鼠体内，对实验组和对照组分为三个治疗组进行比较：CD8消耗组，αCTLA-4加上αPD-1组和同种型对照抗体组。

结果为figure3中的D图和E图，在图D中，与对照组细胞相比，在Pbrm1缺陷型B16F10-Cas细胞注射的小鼠中，αCTLA-4加上αPD-1治疗的小鼠在肿瘤浸润后，最大的肿瘤在30天时才达到400mm^2,而在对照组中，肿瘤达到400mm^2的最长时间也只是25天。

在图E中，与对照组细胞相比，Pbrm1缺陷型B16F10-Cas细胞注射的小鼠中，αCTLA-4加上αPD-1治疗的小鼠的存活率较高，存活时间长。

因此，Pbrm1的失活是否会导致B16F10肿瘤细胞对检查点阻断敏感，αPD-1加上CTLA-4抗体在携带Pbrm1突变体B16F10肿瘤细胞的小鼠中授予治疗益处，但是这种治疗对对照组无效。

在Figure3的图F，与αPD-1加上αCTLA-4抗体处理对照组细胞相比，在使用αPD-1加上αCTLA-4抗体处理Pbrm1缺陷型B16F10-Cas细胞注射的小鼠的肿瘤中，每克肿瘤中检测CD45+免疫细胞的数量显著增加，CD4和CD8 T细胞以及B + CD8 T细胞颗粒酶也出现在Pbrm1缺陷型B16F10-Cas细胞注射的小鼠的肿瘤中。