基于EEG和fNIRS的混合生物标志物的脑成像

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脑成像方法

在过去的二十年中，大脑结构和功能可视化技术的进步为医学、生物医学以及相关领域的研究人员研究大脑的功能和连接提供了大量的机会。各种各样的成像技术使我们能够精确地实现从单个分子到整个大脑的可视化。大脑成像可以发现从事不同功能(如认知、学习等)的网络，并解释大脑不同区域之间的功能连接，以跟踪信息流动。一些常见的神经成像方式，包括计算机断层扫描(CT)，磁共振成像(MRI)，经颅多普勒，正电子发射断层扫描(PET)，单光子发射CT，电生理技术[脑磁图(MEG)和脑电图(EEG)]，功能性近红外光谱(fNIRS)等。大脑成像揭示了大脑中的结构、功能和生化活动，因此成像方式可以分为：①结构成像(CT/MRI)；②功能成像(fMRI/fNIRS/MEG/EEG/PET)。

近红外光谱系统原理及结构

NIRS是一种光学成像技术，通过分析或监测局部血液氧合水平来绘制组织的功能状态。该技术提供了一种安全、无创、便携、经济的方法来评估组织的功能信息。NIRS系统使用两个或多个近红外波长区域(700-1100nm)的光源和光探测器来映射来自人体组织的反射光。其的原理是，组织在近红外光波长中相对透明，只受血液中的血红蛋白干扰，氧和脱氧血红蛋白都吸收不同波长的光。因此，从组织反射衰减的光取决于血液氧合水平，因此它提供了一个间接的代谢活动测量。当大脑活动频繁时，会消耗更多的氧气来为神经元提供足够的能量。缺氧会导致脑缺血、功能损伤和脑组织损伤，最终导致死亡。NIRS通过测量血液氧合指数水平，并在水平低于安全阈值时发出警报，从而实现对组织供氧和耗氧的持续监测。1977年，Jobsis开发了第一个使用NIRS技术来量化脑血流和氧饱和度水平的设备。随着科技的进步和发展，NIRS技术使研究人员和医生以最小的光损失照明脑局部区域成为可能。这为各种测量脑组织中含氧和脱氧血红蛋白分子中近红外光吸收的方法打开了大门。

光在组织内的传播经历吸收、散射和反射。NIRS的工作原理如下：组织在NIR区域相对透明，这有助于光线穿透深层结构和血液中被血红蛋白干扰的组织；氧和脱氧血红蛋白都吸收不同波长的光。在组织中的吸收和散射取决于波长。散射与波长成反比，因此与可见光相比，更有利于近红外光的传输。相反，反射通常是光束与组织表面角度的函数。

一般来说，NIRS系统结构包括NIRS发射器、NIRS检测器、放大单元、滤波单元和控制单元。NIRS系统架构如图1所示。检测单元测量来自组织的光强度的变化，并计算组织的血流动力学。近红外发射器可以是等吸收点周围的两个或两个以上波长的LED/LASER光源；波长越长，组织血流动力学的测量越精确，多检测器和多光电距离法的空间分辨率越高。组织血流动力学可以通过分析光在组织中的传播和使用数值方法来研究。

 图1.fNIRS系统

光在组织中的传播与修正的比尔-朗伯定律：当光子传播到组织中时会被吸收、散射，并在入射点几厘米内反射。这可以用布朗运动来定义。光线在光源和探测器之间沿着一条香蕉状的路径移动，这有助于测量组织的血液动力学。在大脑中，由于白质强烈散射光，光只能穿透大脑皮层深处。这种活动可以通过蒙特卡罗模拟法进行研究和可视化，并且可以通过辐射传递方程或修正的比尔-朗伯定律(MBLL)来分析源与检测器之间的传播路径，从而量化组织的氧合水平。MBLL是NIRS系统中最常用的方程，公式如下：

 其中OD为光密度；Io为入射光强度；I是检测到的光强；ε为分子的消光系数；C是分子的浓度；L为光源到探测器的距离；P是微分路径长度因子，它解释了组织散射导致的光子路径长度增加；G是一个决定探测器测量几何形状的因子。氧和脱氧血红蛋白的变化引起检测强度的变化。当氧和脱氧血红蛋白浓度变化时，消光系数ε和距离L保持不变，也可以假设P和G保持不变。

近红外光谱数据采集系统

NIRS系统主要包括源、检测器和处理单元。光源可以是等吸收点周围两个或两个以上波长的任何近红外发射器，用于以已知强度照射组织。一个探测器，通常是一个光电二极管(PD)或雪崩PD (APD)，放置在离光源(2-6cm)几厘米的地方，对近红外光敏感，探测到存在于组织中的减弱的光强度。如果检测到更多的光子，二极管电流就会增加，使用跨阻抗放大器将二极管电流转换为相应的强度。处理单元最终将传输和检测到的强度的变化转化为组织氧合的可量化值(图2)。

图2.NIRS系统

近红外光谱数据可以根据源和探测器的位置以三种不同的方式记录：

①传输模式NIRS

②反射模式NIRS

③多距离模式NIRS

在传输模式的NIRS中，数据将通过放置源和对侧接收器来记录。这种类型通常用于婴儿的手指、耳垂或舌头区域，以监测组织氧合，而由于信噪比差和在探测器处的强度降低，以至于它不够敏感，不适用于在成人中记录。在反射模式NIRS中，源和探测器相邻放置，距离为2-6cm。这种方法假设有均匀的光吸收和恒定的光学散射效应。在多距离模式中，近红外光谱仪使用两个或多个探测器来精确地绘制检查部位的组织氧合。这是空间分辨光谱中获取精确空间信息的常用方法(图3)。

图3.采集方式：(A)反射模式；(B)透射模式；(C)多距离方法。

光谱仪类型

①时域近红外光谱(TD-NIRS)，也被称为时间分辨系统(如图4B所示)，使用半导体或固态激光源发射几个皮秒的光脉冲。发射的脉冲穿透到组织中，经过吸收和散射，当光子从组织中出来时，它有一个广泛的分布，称为时间点扩散函数(TPSF)。典型组织TPSF的特征是强度相对快速上升，峰值约为600-1000ps，然后缓慢衰减，持续时间通常为几纳秒。TD-NIRS的优点是具有较好的穿透深度和较高的空间分辨率，并具有区分吸收和散射效应的能力。但是，也存在仪器的大小和采样率、实现的复杂性和成本等缺点。

②频域近红外光谱(FD-NIRS)，也称为频率分辨或强度调制系统(图4C)，是利用激光二极管、LED或调制光源照射组织，利用光子计数检测器或增益调制面积检测器测量输出光子的衰减、相移和调制深度。射频调制的光脉冲穿透组织，得到的信号是傅里叶变换的TPSF。它导出的参数与TD-NIRS相同，但只在频域中。频域测量可用这些方法获得：单个波长和固定的光电间距；多个波长和固定的光电间距；单个波长和多个光电间距。其优点是采样率高，吸收和散射效果区分清晰，缺点是穿透深度不够。

③连续波近红外光谱仪(CW-NIRS)使用PD或APD测量通过组织的多波长光的衰减曲线。这里介绍的三种方法中，连续波(CW)近红外光谱(NIRS)是第一个被开发的。与TD-NIRS和FD-NIRS不同，CW-NIRS方法不能产生吸收或散射效应的绝对值。CW-NIRS只能提取相对值，因此可以显示变化值的趋势。CW-NIRS的主要优点是NIRS系统在结构上可以简化，使得设备既轻巧又便宜，这就是为什么目前许多商业化近红外设备都采用了CW-NIRS方法。

图4.光谱仪类型：(A)CW-NIRS；(B)TD-NIRS；(C)FD-NIRS。

脑电图系统结构和原理

脑电图(EEG)是一种非侵入性神经成像技术，可测量大脑神经元细胞的电活动。它记录了大脑锥体细胞突触后梯度电位的总和所引起的电压波动，使用金属电极收集头皮上的电位。EEG系统是通过电极、放大器和过滤器来记录电活动的。临床EEG遵循国际联合会10-20系统，将电极置于头皮区域。EEG是诊断癫痫、肿瘤和其他脑部疾病的最佳方法。EEG信号的正常范围为0.5~100Hz，具有良好的时间分辨率，但空间分辨率较差。高时间分辨率也使EEG成为观察频域表征的重要脑成像方式之一，使其适合于脑功能连接的研究。

数十亿的神经元负责大脑的电活动。动作电位的出现是由于离子在细胞膜上的交换，同种电荷的离子相互排斥，产生局部电流，这种现象称为容积传导。这种局部电流主要是由于Na+、K+、Ca++和Cl-离子按膜电位控制的方向被推出膜外。金属电极(通常为Ag/AgCl)与大脑或头皮表面接触，在该位置采集局部电流产生的电位。记录下大脑表面任意两个电极随时间变化的电势差，我们就得到了脑电图。脑电图反映了数十亿具有相似空间取向的锥体神经元的同步活动总和(图5)。

图5.兴奋性突触引起的神经元突触前和突触后的活动和动作电位。

头皮上的EEG活动显示不同频段的振荡。这些带中的每一个都与大脑的各种功能状态有关(例如，思考、睡眠、学习)。这些频带被称为脑电波，并被分为四大类(图6)：

Delta (0.5-4Hz)

Theta (4-8Hz)

Alpha (8-13Hz)

Beta (13-30Hz)

这些脑电活动本质上是正弦的，通常在头皮区域进行从峰到峰的测量，范围在0.5μV到100μV之间。利用傅里叶变换对原始脑电信号进行频谱分析。在功率谱中，不同频率的正弦波的贡献是可见的。虽然频谱是连续的，范围从0Hz到采样频率的一半，但个体的大脑状态可能使某些频率更占优势。

 图6.典型脑电波

脑电图数据采集系统

EEG电极对头部表面的电位变化很敏感。两个电极之间的电势差在微伏范围内，用放大器将其放大到可以精确进行数字化处理的范围。模数转换器将模拟数据转换为数字，计算机或任何相关设备存储和显示所记录的数据。整个数据记录设置如图7和图8所示。

图7.(A)双极导联；(B)单极测量。

图8.EEG数据记录装置

关于电极放置程序，10-20电极放置系统是国际脑电图和临床神经生理学联合会在1958年采用的标准化物理电极放置程序。在此过程中，为了覆盖大脑的所有区域，头部被分割成与颅骨主要标志(鼻根、枕骨隆突和耳前叶)成比例的距离。标签10-20以百分比表示耳朵和鼻子之间的距离，并在那里选择电极点。电极放置位置根据邻近的大脑区域进行标记：F(额)，C(中央)，T(颞)，P(后)和O(枕)。大脑左半球的电极点名称为奇数，右半球为偶数。按照惯例，从主体的角度来考虑左右半球(图9)。

图9.10-20电极放置

fNIRS和EEG系统在脑成像中的应用

脑电图(EEG)和功能性近红外光谱(fNIRS)是婴儿和儿童研究中常用的神经成像技术。EEG-fNIRS可以无创地实时测量被试的大脑活动。两种方式测量不同的生理信息，EEG反映的是脑电活动(神经元放电)，而fNIRS反映的是血容量和氧合状态。将两者结合起来可以以较低的成本提供有关大脑状态的高时间和空间分辨率的信息。目前，有研究已经探索了将这两种模式结合起来进行大脑活动的测量。

EEG-fNIRS在评估认知和心理科学方面是一个很有前途的工具，因为它提供了便携式和低成本的系统，在测量神经活动方面相对来说比较容易。EEG-fNIRS也是婴儿和儿童神经成像的理想选择，因为它不需要被试保持完全静止不动，而是允许他们在环境中自由地互动。此外，由于与成人被试相比，婴儿的头皮和颅骨更薄，因此EEG和fNIRS对大脑的敏感度也更高。这些优势使得fNIRS被广泛应用于典型和非典型神经发育的研究中，包括面孔加工、数字加工、语言习得、社交和神经运动发育等。对典型功能发育的研究主要集中在注意缺陷多动障碍和自闭症谱系障碍。

理想地研究社会大脑包括想象在自然环境中进行社会互动的人。超扫描技术是一种通过测量两人或多人在实时互动中同时进行的大脑活动来实现这类研究的技术。到目前为止，各种成像方式如fMRI、MEG、EEG和fNIRS已被用于超扫描研究。其中，fNIRS和EEG是最合适的模式，因为它们提供了社会互动所需的自然环境，而EEG在超扫描过程中结合fNIRS可以对社会互动的本质提供宝贵的见解。

脑生物标志物

根据生物标志物工作组的定义，生物标志物被定义为一种被客观测量和评估的特征，作为正常生物过程、致病过程或治疗干预的药物学反应的指标。生物标志物作为一种工具，使得医学领域的研究人员在预测疾病的开始、诊断和进展或简单地排除疾病障碍方面的工作变得更加容易。目前，还没有生物标志物满足大脑的所有这些标准。生物标志物可以根据其适应技术大致分为临床生物标志物、生化生物标志物和成像生物标志物(图10)。

图10.脑生物标志物分类

特异性疾病的标志物

研究人员一致认为，单一的生物标志物可能不足以反映某种疾病的复杂性。对于一些神经退行性疾病来说，开发和识别生物标志物是一种非常简单的方法，但对于阿尔茨海默症和肌萎缩侧索硬化症和PD这些神经退行性疾病来说，生物标志物相对缺乏。人们不断采取许多措施来探索生物标志物。其中，阿尔茨海默症神经成像计划(ADNI)于2004年启动，ADNI在发现阿尔茨海默症的生物标志物方面取得了重要进展，并重新激发了专注于疾病治疗的研究。此外，迈克尔·j·福克斯帕金森研究基金会表示，生物标记物可以根据疾病的进展和现存的疾病进行分析。一个进展性生物标记物(或进展性标记物)可以通过其随着疾病进展而变化的性质来测量。诊断性生物标志物可以通过与疾病存在相关的生理特征来测量。进展和诊断标记将有助于转变治疗神经退行性疾病的方法。

关联生物标志物

生物标志物是识别和解决真正问题的最佳方法之一。理想的生物标志物可以作为揭示疾病的主要催化剂，能够通过干预改变疾病。为了确定潜在的最佳生物标志物，请参考Austin Bradford Hill制定的关于分析关联确定因果关系的指南。Hill提出了九个方面的联系来评估职业和环境暴露与疾病结果之间的无数假设关系。它们是关联强度、一致性、特异性、时间性、生物梯度、合理性、连贯性、实验性和类比性。这些关联的许多方面可以整合到机制中，以发现特定疾病的最佳生物标志物。

理想的替代生物标志物

当与疾病相关的紊乱生理过程和干预行为的机制被彻底明晰时，替代终点最有用。理想的替代生物标志物应当具备这些品质：适应不同的神经退行性疾病；是疾病发生或改变的根本原因；稳健适应疾病的进展和诊断；与神经退行性过程的膨胀/损耗成正比；必须能够通过生物标志物的中期变化来预测疾病进展中的持久变化；适用于具有不同特征的各种人群(如年龄、性别、种族)；测量方法可重复使用；使用安全。

生物标志物：优势和局限性

生物标志物成本低，更容易测量。生物标志物还有助于识别和确定自然历史中最早事件的顺序，减少疾病和暴露的错误分类程度，以及有助于建立可变性和效应修正。同时，生物标志物也存在一些问题：执行成本较高；有时间限制；容易出现实验室错误。除此之外，还存在一些局限性，如在启动发现阶段之前缺乏不同的选择程序，在识别生物标志物表征/验证策略方面缺乏变化，以及临床试验中使用的分析技术缺乏稳健性。

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