学习小组Day7-测序相关知识-April

一、测序过程和原理

（一） ：一代测序：sanger测序

双脱氧终止反应法：利用双脱氧核苷酸 ddNTP（带有放射性标记，2‘和3'没有羟基）
特点：测序读长可达1000bp，准确性高达99.999%，在验证序列以及验证基因组组装完整性方面都是金标准。

（二）：二代测序：Illumina测序原理

基于可逆终止的、荧光标记dNTP；边合成，边测序
Flowcell（流动池） 8条通道，2种引物（共价键连接）
（1）构建DNA文库：DNA序列两段加接头
特点：
1）插入DNA序列各种各样
2）两头接头序列已知
方法：
1）超声波打断基因组DNA
2）两头加酶
3）Klenow酶在3‘端加上A碱基
4）加接头（实现桥式扩增，高效；可以实现双端测序）
（2）桥式PCR：将文库种到芯片上并进行扩增
方法：
1）将文库加入芯片上（互补杂交）
2）加入dNTP和聚合酶-->合成互补序列
3）加入NaOH，原文库冲走
4）加入中和液，互补杂交-->循环
5）得到指数扩增的DNA链
（3）测序
加入被叠氮基修饰的dNTP
一个循环只能加入一个碱基
通过荧光推断新合成碱基种类
重复repeat
（4）读取index/barcode
文库接头上的特异性标记（标记样本来源）
read2测序引物：特异性结合在index旁边，读取index的6-8个碱基，确定样本来源。
（5）双端测序
read3引物
提高测序效率
示意图

二、都有哪些类型的测序

sanger，Illumina，三代测序（SMRT技术，纳米孔单分子测序技术）
名词结构化：

1.基因组学（核酸序列分析）

（1）全基因组测序（WGS）
（2）全外显子组测序（WES）
（3）简化基因组测序（RRGS）
①RAD-Seq ②GBS ③2bRAD ④ddGBS（也就是ddRAD）
作用：（1）基因组作图（遗传图谱、物理图谱、转录本图谱）（2）核苷酸序列分析（3）基因定位（4）基因功能分析
其它：以全基因组测序为目标的结构基因组学以基因功能鉴定为目标的功能基因组学

2.转录组学（基因表达分析）

（1）mRNA-Seq
（2）IncRNA-Seq（长链非编码RNA）
（3）sRNA-Seq（主要是miRNA-Seq）

3.蛋白质组学

（1）蛋白质组数据处理、蛋白及其修饰鉴定
（2）构建蛋白质数据库、相关软件的开发和应用
（3）蛋白质结构功能预测
（4）蛋白质连锁图

4.代谢组学

（1）代谢物指纹分析
（2）代谢轮廓分析

三、常用数据格式

DNA序列表征

Fastq

1：由‘@’开始，后面跟着序列ID和可选的描述，序列ID是唯一的；
2：碱基序列；
3：由‘+’开始，后面是序列的描述信息；
4：第二行序列的质量评价(quality value)。

Fasta

1：以“>”为开头，fasta格式标志。
2：序列ID号，gi号，NCBI数据库的标识符，具有唯一性。
格式为：gi|gi号|来源标志|序列标志（接收号、名称等），若某项缺失可以留空，“|”保留。
3：序列描述。
4：碱基序列，序列中允许空格、换行、空行，一般一行60个。

GenBank & EMBL

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三、常用数据格式.png

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